孔繁勇，李連賀，王朝山，張強(qiáng)

1北京市順義區(qū)醫(yī)院耳鼻喉科，北京101300

2遼寧省朝陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧 朝陽(yáng)122000

喉癌是一種來(lái)源于頭頸部上皮的惡性腫瘤，是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，喉鱗狀細(xì)胞癌是其主要病理類型，約占90%[1-2]。近年來(lái)，分子靶向治療喉鱗狀細(xì)胞癌取得一定進(jìn)展，但臨床療效仍不夠理想，基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向臨床研究的效率較低，因此，探索喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有效的分子靶點(diǎn)，對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的治療具有重要意義[3]。X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（zinc finger protein X-linked，ZFX）是鋅指蛋白家族成員，含有13個(gè)C2H2型的鋅指結(jié)構(gòu)。ZFX基因位于哺乳動(dòng)物的X染色體上，早期研究顯示，ZFX基因與哺乳動(dòng)物的性別有關(guān)，隨后研究認(rèn)為，ZFX基因在多種類型的干細(xì)胞及腫瘤組織中表達(dá)水平較高，從而被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)，ZFX在膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平較高，并可影響腫瘤組織的生物學(xué)行為[6-8]，推測(cè)ZFX可能也是喉鱗狀細(xì)胞癌分子靶向治療的一個(gè)靶點(diǎn)，因此，本研究旨在探討ZFX在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2018年7月北京市順義區(qū)醫(yī)院和遼寧省朝陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的喉鱗狀細(xì)胞癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未接受過(guò)化療、放療及生物治療等；臨床資料及隨訪資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝、腎系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾??；合并嚴(yán)重的心腦血管疾病及感染性疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入68例喉鱗狀細(xì)胞癌患者，其中男44例，女24例；年齡15～75歲，＜60歲32例，≥60歲36例；美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤分期第八版TNM分期[9]：I期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ期26例，Ⅳ期15例；分化程度：高分化13例，中分化14例，低分化41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。同時(shí)取68例喉鱗狀細(xì)胞癌患者的喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行研究。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人ZFX多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，RMI128切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，BH-2顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化法檢測(cè)ZFX的表達(dá)

采用免疫組化法檢測(cè)ZFX蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況。石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度4 μm，于二甲苯I、Ⅱ脫蠟10 min，100%、95%、85%、75%梯度乙醇逐級(jí)脫水5 min，切片于3%雙氧水室溫下滅活25 min，然后在枸櫞酸鈉緩沖液中37℃進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊抗血清封閉30 min，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察ZFX蛋白的染色情況。選取PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

ZFX蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片選取5個(gè)高倍視野對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的著色程度進(jìn)行評(píng)分：未染色計(jì)0分，淺黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2分，棕褐色染色計(jì)3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為1%～24%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為25%～49%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為50%～74%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為75%～100%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比相乘得最終總分，0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），≥3分為陽(yáng)性表達(dá)，＜3分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中ZFX陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為79.41%（54/68），明顯高于癌旁正常組織的29.41%（20/68），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.267，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于分化程度為中高分化、TNM分期為I～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同性別、年齡喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)情況比較（n=68）

3 討論

鋅指蛋白是一種能夠與Zn2+穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)，可自我折疊并形成手指結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同可以分為C2H2型、C6型和C4型，并根據(jù)自身分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。ZFX作為鋅指蛋白家族一員，位于X染色體，在脊椎動(dòng)物中高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胚胎干細(xì)胞和人造血干細(xì)胞中的ZFX后，干細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，ZFX的表達(dá)恢復(fù)后，細(xì)胞也恢復(fù)生長(zhǎng)，表明ZFX在干細(xì)胞的更新過(guò)程中起著重要作用[11]。目前，研究多集中于ZFX與腫瘤的關(guān)系上，多項(xiàng)研究顯示，ZFX與膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、非小細(xì)胞肺癌及胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-7]。Li等[5]檢測(cè)53例腎細(xì)胞癌組織及51例癌旁正常組織中ZFX的表達(dá)情況，腎細(xì)胞癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)率為79.2%，明顯高于癌旁正常組織的17.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明ZFX在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)；同時(shí)，該研究結(jié)果顯示，ZFX的陽(yáng)性表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者年齡、性別和吸煙情況無(wú)關(guān)，但與TNM分期、腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；此外，Kaplan-Meier分析顯示，ZFX陽(yáng)性表達(dá)患者的病死率高于陰性表達(dá)患者，COX回歸分析顯示，ZFX表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。岳斌等[12]采用免疫組化法檢測(cè)67例胰腺癌組織及癌旁組織中ZFX的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，胰腺癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)率為82.09%，高于癌旁組織的50.75%，胰腺癌組織中ZFX的表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究也采用免疫組化法檢測(cè)68例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中ZFX的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為79.41%，明顯高于癌旁正常組織的29.41%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明ZFX在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)水平較高，這可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。

研究顯示，腫瘤組織中ZFX表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲和凋亡等過(guò)程均具有明顯的抑制作用，如miRNA-493、miRNA-144，可通過(guò)靶向下調(diào)ZFX的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲過(guò)程[13-14]。研究顯示，下調(diào)ZFX的表達(dá)不僅可以抑制非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的增殖及細(xì)胞克隆形成能力，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，減少細(xì)胞遷移數(shù)目，還可降低荷瘤小鼠比例及平均腫瘤體積[15]。Ma等[16]的研究顯示，ZFX在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且敲除ZFX后可明顯的抑制舌鱗狀細(xì)胞癌TCA-8113細(xì)胞株的增殖及細(xì)胞集落形成能力，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Fang等[8]研究顯示，42例腎細(xì)胞癌組織中ZFX蛋白及ZFXmRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯上調(diào)，且慢病毒介導(dǎo)的ZFXshRNA不僅能夠下調(diào)腎癌786-0和ACHN細(xì)胞中ZFX的表達(dá)，還可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，這可能通過(guò)ZFX對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma/leukemia 2 associated X protein，BAX）和caspase 3的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZFX的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于分化程度為中高分化、TNM分期為I～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明ZFX可能作為喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，ZFX在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平較高，可能作為喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。