陳立智，胡軍，傅厚豐，符敏，虞道銳

1瓊海市人民醫(yī)院普通外科，海南 瓊海 571400

2海南醫(yī)學院機能實驗室，?？?571199

據(jù)《2015中國腫瘤登記年報》數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直 腸癌的發(fā)病率和病死率在所有腫瘤中均位居第5位[1]。2000—2014年全球腫瘤生存率變化趨勢監(jiān)測研究報告顯示，中國結(jié)腸癌患者的5年凈生存率僅為56.9%，明顯低于美國、韓國、日本等發(fā)達國家[2]。因此結(jié)腸癌的診治工作成為亟待解決的社會公共衛(wèi)生問題。目前在美國國立綜合癌癥網(wǎng) 絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南上結(jié)腸癌的治療方式主要以手術切除和放化療為主[3]，但手術切除的并發(fā)癥多、放化療的不良反應大一直是治療結(jié)腸癌的難題，尋找新的腫瘤治療方法一直是近年來醫(yī)學領域的重點研究課題。伊維菌素（Ivermectin）是由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成大環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素[4]，是新型的廣譜、高效、低毒抗生素類抗寄生蟲藥物，對體內(nèi)外寄生蟲特別是線蟲和節(jié)肢動物均有良好的驅(qū)殺作用[5]。近年來，伊維菌素被證實可抑制白血病和卵巢癌細胞的生長，也可通過降低蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycinm，MTOR）信號通路的活性誘導線粒體功能障礙和氧化應激抑制膠質(zhì)母細胞瘤的生長和血管生成[6-8]，這表明伊維菌素作為抗腫瘤藥物具有很大的發(fā)展?jié)摿?。?jù)多項研究報道，肌醇六磷酸、喹唑啉酮、漢黃芩苷等多種藥物均能夠降低AKT/MTOR通路的活性從而抑制結(jié)腸癌細胞的生長[9-11]，這提示AKT/MTOR信號通路是結(jié)腸癌藥物治療的重要靶點之一。因此，本研究探討伊維菌素是否能夠抑制結(jié)腸癌細胞株HCT-116、SW-480的生長及其作用機制是否與AKT/MTOR信號通路有關，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

人結(jié)腸癌細胞株SW-480、HCT-116均購自中國科學院上海細胞庫。伊維菌素購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA（1X）胰酶、青鏈雙抗、胎牛血清均購自美國Gibco公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均購自中國上海碧云天生物科技公司，Anti-微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）、Anti-p62、Anti-微管相關蛋白1輕鏈 3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Anti-AKT、Anti-磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylation AKT，p-AKT）、Anti-MTOR、Anti-磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation MTOR，p-MTOR）、Anti-beta actin抗體、兔二抗均購自美國Abcom公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測結(jié)腸癌細胞活性 選取處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細胞株SW-480、HCT-116，0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮制成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度按每孔5×103/100μl接種于96孔板，待細胞貼壁后，給予梯度濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μmol/L的伊維菌素溶液處理，同時設置不給藥的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為對照組，每組設5個復孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于終止培養(yǎng)前4 h加入10 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)37℃孵育4 h棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，在570 nm下測定吸光度（optical density，OD）值。

1.2.2 流式細胞術檢測結(jié)腸癌細胞凋亡情況 選取處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細胞株SW-480、HCT-116，按1×105/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后分別給予伊維菌素5、10 μmol/L以及PBS處理，24 h后進行細胞凋亡檢測。用0.25%胰酶消化并收集細胞，800 r/min離心3 min，棄上清，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數(shù)。取105個重懸的細胞，800 r/min離心3 min，棄上清，加入195μl AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細胞，然后先后分別加入 Annexin V/FITC和 PI，室溫避光孵育 10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞各期凋亡率。

1.2.3 免疫熒光檢測結(jié)腸癌細胞內(nèi)自噬相關蛋白LC 3-Ⅱ的表達水平 采用0、5 μmol/L伊維菌素按1.2.2步驟處理細胞24 h后，PBS清洗細胞3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗，0.1%Triton 100室溫破裂細胞膜20 min，PBS清洗，1%胎牛血清室溫封閉30 min，PBS清洗，加入一抗（根據(jù)說明書確定稀釋比例），4℃過夜，PBS清洗3次，加入Alexa Flour二抗（根據(jù)說明書確定稀釋比例），4℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入10 ng/ml DAP（I1∶500），4℃避光孵育20 min，PBS清洗3次；倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4 透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體形成 采用0、5 μmol/L伊維菌素按1.2.2步驟處理細胞24 h后，收集（2×105）～（1×106）個細胞，離心棄上清。用PBS洗滌1次，離心棄上清，20倍樣品體積以上的2.5%戊二醛PBS固定4 h，0.1 mol/L PBS（用量0.5～1.0 ml）漂洗15 min 2次，1%鋨酸固定液固定1 h，ddH2O漂洗10～15 min 2次，2%醋酸鈾固定/染色30 min，乙醇梯度脫水，滲透，包埋，聚合，用超薄切片機切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體形成情況。

1.2.5 Westernblot法檢測蛋白表達情況 為確定伊維菌素能否誘導結(jié)腸癌細胞自噬，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測自噬標志蛋白LC-3Ⅱ、p62蛋白表達情況。采用0、5、10 μmol/L伊維菌素按1.2.2步驟處理細胞24 h后收集細胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）加樣緩沖液混合，95%變性10 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)說明書確定稀釋比例加入兔抗人Anti-LC3-Ⅱ、Anti-p62、Anti-AKT、Anti-p-AKT、Anti-MTOR、Anti-p-MTOR、Anti-beta actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后按1∶2000加二抗，室溫孵育2 h，洗膜，采用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒曝光，Quantity One圖像分析軟件分析目的條帶和內(nèi)參條帶的OD值，蛋白表達的灰度值用Image J軟件測定，計算蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 伊維菌素對結(jié)腸癌細胞活性的影響

伊維菌素對HCT-116、SW-480結(jié)腸癌細胞的生長均有明顯抑制作用，細胞活力均隨伊維菌素濃度的升高而降低（F=90.85、2518.61，P＜0.01）。（表1）

表1 不同濃度的伊維菌素作用于結(jié)腸癌SW-480、HCT-116細胞24 h后細胞OD值的比較（±s）

表1 不同濃度的伊維菌素作用于結(jié)腸癌SW-480、HCT-116細胞24 h后細胞OD值的比較（±s）

注：與伊維菌素濃度為0 μmol/L細胞比較，aP＜0.05，bP＜0.01

伊維菌素濃度（μmol/L）0 2.5 5.0 10.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 HCT-116細胞1.27±0.10 1.22±0.08 1.11±0.11 0.87±0.09a 0.62±0.07b 0.40±0.06b 0.18±0.01b 0.08±0.02b 0.06±0.01b SW-480細胞1.15±0.01 1.11±0.01b 1.04±0.03b 0.90±0.00b 0.51±0.02b 0.10±0.01b 0.08±0.01b 0.08±0.01b 0.06±0.00b

2.2 伊維菌素對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響

5、10 μmol/L伊維菌素作用于HCT-116結(jié)腸癌細胞后，細胞凋亡率均明顯高于0 μmol/L伊維菌素，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-12.887、-26.458，P＜0.01）；5、10 μmol/L伊維菌素作用于SW-480結(jié)腸癌細胞后，細胞凋亡率均明顯高于0 μmol/L伊維菌素，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-15.618、-18.643，P＜0.01）。（表2）

表2 不同濃度的伊維菌素作用于SW-480、HCT-116結(jié)腸癌細胞24 h后的細胞凋亡率（%，±s）

表2 不同濃度的伊維菌素作用于SW-480、HCT-116結(jié)腸癌細胞24 h后的細胞凋亡率（%，±s）

伊維菌素濃度（μmol/L）HCT-116細胞SW-480細胞051 0 3.10±0.51 12.67±0.92 21.77±0.86 3.40±0.91 17.67±0.92 20.63±0.94

2.3 伊維菌素對結(jié)腸癌細胞中自噬標志蛋白LC- 3Ⅱ、p 62表達的影響

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，5、10 μmol/L伊維菌素作用于結(jié)腸癌細胞HCT-116和SW-480 24 h后，與0 μmol/L伊維菌素相比，結(jié)腸癌細胞HCT-116和SW-480內(nèi)LC-3Ⅱ熒光強度均明顯增加，且隨伊維菌素濃度的升高熒光強度逐漸增強（圖1）。

5、10 μmol/L伊維菌素作用于結(jié)腸癌細胞HCT-116、SW-480后，與0 μmol/L伊維菌素相比，結(jié)腸癌HCT-116細胞LC-3Ⅱ蛋白相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-4.18、15.46，P＜0.01）；p62蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-2.53、3.20，P＜0.05）；結(jié)腸癌SW-480細胞LC-3Ⅱ蛋白相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-5.23、6.65，P＜0.01）；p62蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-2.01、3.47，P＜0.05）（圖2、表3）。

圖1 免疫熒光法檢測HCT-116、SW-480結(jié)腸癌細胞內(nèi)LC- 3Ⅱ的表達

圖2 Western blot法檢測HCT-116、SW-480結(jié)腸癌細胞內(nèi)LC- 3Ⅱ、p62蛋白表達情況

表3 不同濃度的伊維菌素作用于SW-480、HCT-116結(jié)腸癌細胞24 h后LC- 3Ⅱ、p62蛋白的相對表達量（±s）

表3 不同濃度的伊維菌素作用于SW-480、HCT-116結(jié)腸癌細胞24 h后LC- 3Ⅱ、p62蛋白的相對表達量（±s）

0 5 1 0 HCT-116 LC-3Ⅱ0.28±0.01 0.37±0.04 0.49±0.02 p62 0.89±0.09 0.69±0.10 0.54±0.16 SW-480 LC-3Ⅱ0.13±0.01 0.21±0.02 0.28±0.03 p62 0.71±0.11 0.54±0.08 0.36±0.12

2.4 伊維菌素對結(jié)腸癌細胞中自噬體形成的影響

采用透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量，結(jié)果顯示，5 μmol/L伊維菌素處理結(jié)腸癌HCT-116和SW-480細胞24 h后，與0 μmol/L伊維菌素相比，HCT-116、SW-480結(jié)腸癌細胞內(nèi)自噬體的形成明顯增多。（圖3）

圖3 透射電鏡下觀察HCT-116、SW-480結(jié)腸癌細胞內(nèi)自噬體的形成數(shù)量（×8900）

2.5 伊維菌素對AKT/MTOR通路蛋白表達情況的影響

5、10 μmol/L伊維菌素處理細胞24 h后p-AKT和p-MTOR蛋白表達均低于0 μmol/L伊維菌素，且隨伊維菌素濃度的升高而降低，呈劑量依賴性，提示伊維菌素能夠抑制AKT/MTOR通路。（圖4）

圖4 Western blot法檢測伊維菌素處理后結(jié)腸癌細胞內(nèi)AKT、MTOR、p-AKT和p-MTOR蛋白的表達

3 討論

本研究結(jié)果證實了伊維菌素能夠誘導結(jié)腸癌細胞自噬從而抑制其生長，誘導結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生自噬的調(diào)控機制是通過抑制AKT/MTOR通路磷酸化水平的表達。自噬在一定程度上對細胞來說具有維持細胞能量循環(huán)的作用，當自噬激活增加時可誘導細胞發(fā)生自噬性死亡，這也是多種抗腫瘤藥物的作用途徑之一。

自噬過程主要可以分為3個步驟，首先當細胞受到自噬誘導信號調(diào)控時細胞質(zhì)成分被吞噬細胞或特異隔離膜包圍起來形成雙脂層、半球形的吞噬泡。隨后吞噬泡不斷地延伸將細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等成分包裹起來形成密閉的球狀自噬體，此過程中LC3-Ⅱ蛋白在自噬前體和自噬體的內(nèi)外膜均有表達，在膜外表達的LC3-Ⅱ脫離自噬體入細胞質(zhì)，因此LC3-Ⅱ是自噬形成的標志性蛋白之一[12]。最后成熟的自噬體在選擇性自噬接頭蛋白p62的作用下與溶酶體融合并在溶酶體中降解自噬體內(nèi)容物[13]。在本研究中，采用伊維菌素處理結(jié)腸癌細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ蛋白的表達升高、p62蛋白的表達降低。透射電鏡結(jié)果也表明伊維菌素處理結(jié)腸癌細胞后，細胞內(nèi)有大量的自噬體形成。這兩個實驗結(jié)果均表明伊維菌素可誘導細胞內(nèi)自噬體增加。但自噬是一個動態(tài)過程，細胞內(nèi)自噬體的增加可能是自噬體與溶酶體融合受阻，也有可能是自噬持續(xù)產(chǎn)生。所以今后的研究工作需要證實伊維菌素誘導細胞內(nèi)自噬體增加的作用是阻礙自噬體與溶酶體結(jié)合還是促進自噬。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是促進細胞存活和維持細胞正常功能的關鍵信息分子[14]。研究表明AKT可通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，將信號向下傳遞至MTOR，MTOR可通過AKT磷酸化而被激活，磷酸化的MTOR不僅可以加速細胞周期也可以通過清除泛素蛋白從而抑制自噬的發(fā)生，因此AKT/MTOR信號通路與細胞內(nèi)自噬的產(chǎn)生有著重要的調(diào)控作用[15-16]。本研究通過檢測細胞內(nèi)AKT/MTOR通路蛋白磷酸化水平的表達情況來探討伊維菌素誘導細胞自噬的分子機制。結(jié)果表明，伊維菌素各劑量組均可抑制結(jié)腸癌細胞內(nèi)p-AKT、p-MTOR的蛋白表達，表明伊維菌素可以抑制AKT/MTOR通路的活化，這與Dou等[17]報道的伊維菌素可以通過調(diào)控AKT/MTOR信號通路發(fā)揮抗乳腺癌作用的結(jié)果一致，提示伊維菌素抑制AKT/MTOR通路的活化是伊維菌素誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生自噬抑制結(jié)腸癌細胞生長的作用機制之一。但此作用在后期的研究中將利用AKT穩(wěn)定表達于結(jié)腸癌細胞株進一步驗證。

綜上所述，伊維菌素可通過誘導結(jié)腸癌細胞自噬從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，其機制可能與抑制AKT/MTOR通路的活化有關。但在后期的研究中還需要利用更多的實驗方法對此作用機制進行充分的認證，為結(jié)腸癌的臨床治療及藥物研究提供依據(jù)。