姚小東 李孝剛，? 丁昌峰 韓正敏 王興祥

（1 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037）（2 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京土壤研究所），南京 210008）

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。2 0 1 6 年全國種植面積僅次于油菜，高達(dá)4 6 6 萬hm2，總產(chǎn)量1571萬t，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易中占有重要地位［1］。近年來，由于花生產(chǎn)區(qū)規(guī)模相對集中，常常多年成片、大規(guī)模種植，而隨著種植年限增加，連作障礙現(xiàn)象普遍發(fā)生，導(dǎo)致花生產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、生育狀況變差以及病蟲害嚴(yán)重等諸多生產(chǎn)問題，成為制約我國花生產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸［2］。

花生連作障礙的主要原因可能是，長期單一種植花生導(dǎo)致特定的根系分泌物刺激土壤中病原微生物大量生長并在根部定殖、進(jìn)而破壞了根組織的正常分化和生理活動(dòng)，使水分和養(yǎng)分運(yùn)輸不足。同時(shí)，長期連作后，根系分泌物進(jìn)入土壤也會(huì)對微生物種群進(jìn)行特異性篩選，改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)［3］。很多研究認(rèn)為連作后土壤微生物多樣性下降，細(xì)菌總量下降而真菌顯著上升，連作土壤由“細(xì)菌性”轉(zhuǎn)為“真菌性”土壤［4,5］。諸如，尖孢鐮刀菌、黑曲霉等真菌、青枯勞爾氏菌均是引起花生土傳病害發(fā)生的重要病原菌［6,7］，然而這些微生物在作物根際微域的分布、豐度與侵染力密切相關(guān)，對作物土傳病害的發(fā)生具有重要影響。但是，已有研究大多未考慮到根際土與根表土中微生物因受根系生理生化影響不同而產(chǎn)生的差異，多數(shù)研究中僅聚焦于非根際土壤或根區(qū)土，缺乏比較研究，尤其是連作作物根表微生物群落結(jié)構(gòu)特征。此外，除典型病原菌外，連作栽培下根系分泌物對某些真菌類型也有化感誘導(dǎo)作用，如大豆根系分泌物能顯著促進(jìn)粉紅粘帚菌的生長，連作太子參根際踝節(jié)菌大量繁殖［8, 9］。

近年來，高通量測序被廣泛應(yīng)用于連作障礙研究。研究發(fā)現(xiàn)，花生長期連作后引起潛在病原菌如Fusarium sp.、Phoma sp.和Bionectria sp.相對豐度的增加［10］。然而，這些病原菌相對豐度的增加并不能準(zhǔn)確表明其在土壤中的實(shí)際變化。此外，由于擴(kuò)增片段短，大量菌群難以鑒定到種，且缺乏實(shí)體菌株的獲得，限制了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。據(jù)此，本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)和長片段基因克隆方法，通過比較輪作與連作花生根表、根際及非根際微生物數(shù)量、可培養(yǎng)微生物種群結(jié)構(gòu)，以期從土壤可培養(yǎng)微生物組成的角度探討連作花生土傳病害高發(fā)的微生態(tài)機(jī)制，從而為解決花生連作障礙問題提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于江西省鷹潭市余江縣劉家站一分場典型的丘陵區(qū)紅壤旱地（116°55′E，28°12′N），花生種植普遍，兼有其他旱地作物類型如西瓜、紅薯等。土壤母質(zhì)發(fā)育類型為第四紀(jì)紅色黏土，年均氣溫17.6 ℃，年均降水量1750 mm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2017年花生播種前期（3月）在區(qū)域內(nèi)選擇2種典型的種植模式：1）連作，2012—2017年連續(xù)種植花生地塊；2）輪作，近年來采用各種旱作物輪換種植的地塊。連作花生地塊面積約為0.35hm2，花生栽培品種為贛花5號，每年4月上旬播種、7月下旬收獲，秋冬季拋荒。輪作地塊近5年分別采用花生、西瓜和紅薯進(jìn)行倒茬種植，地塊面積約為0.5hm2，2016年種植季為西瓜，同樣秋冬季拋荒。

播種前采集2個(gè)地塊土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室分析土壤理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示，輪作和連作土壤有機(jī)質(zhì)、pH、全氮、全磷、全鉀及速效養(yǎng)分等均無顯著性差異。于2017年4月上旬，2個(gè)地塊均開始播種花生，品種為贛花5號。花生播種株距10cm，行距50cm，每穴播種2粒。在播種前基施尿素150 kg·hm-2、氯化鉀 225 kg·hm-2、鈣鎂磷肥1125 kg·hm-2；其他管理措施如中耕培土、除草均按常規(guī)模式進(jìn)行。

表1 連作、輪作花生土壤主要理化性質(zhì)比較Table 1 Soil physical and chemical properties relative to cropping systems, monocropping or rotation

1.3 花生生長測定及病害分析

針對花生青枯病的分析策略如下：于2017年6月2日隨機(jī)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選擇20株花生，共調(diào)查100株，分0～4級調(diào)查花生青枯病發(fā)生程度。0為沒有癥狀，1為花生25%以下的葉子萎焉，2為25%～50%葉子萎焉，3為75%以上的葉子萎焉但植株仍然存活，4為整個(gè)植株死亡。針對花生根腐?。河?017年7月6日，隨機(jī)5點(diǎn)調(diào)查，每點(diǎn)拔取20株花生，共100株，分0～4級調(diào)查花生根部病害程度。0為沒有癥狀，1為25%花生根部發(fā)病，2為25%～50%根部發(fā)病，3為50%～75%根部發(fā)病，4為整個(gè)根部發(fā)黑，植株死亡。

考種測產(chǎn)：花生收獲時(shí)（8月5日），每個(gè)地塊采集5個(gè)1 m×1 m的樣方，收獲花生莢果，折算單位面積的實(shí)際產(chǎn)量。同時(shí)，測定花生植株各生長指標(biāo)和根瘤數(shù)量。

1.4 土壤樣品采樣

于花生花針期（6 月2 日）和結(jié)莢期（7 月6日），每塊樣地按5點(diǎn)取樣法采集不同微域土壤，每點(diǎn)隨機(jī)選取3株混合作為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)地塊共采集5個(gè)重復(fù)樣品用于分析?；ㄉp輕拔出后，拍打整個(gè)根系使得疏松土塊全部脫落，利用無菌毛刷收集附在根系表面的土壤作為“根際”土壤。同時(shí)，在兩行植株中間的無根區(qū)域取0～20cm的耕層土壤作為相對的“非根際”土壤。將采過根際土的植株根系剪下稱重，置于裝有50 mL無菌水的三角瓶中，搖床上100 r·min-1振蕩30 min后取出根系，吸水紙吸盡根周圍的水分后再稱重，2次質(zhì)量之差即為根表土質(zhì)量［11］；溶解于水中的土壤作為“根表土壤”用于后續(xù)分析。其他土壤樣品過2 mm篩混勻，去除根系、植物殘?bào)w以及其他雜質(zhì)，4 ℃保存，3 d內(nèi)完成土壤微生物區(qū)系測定。

1.5 土壤微生物數(shù)量測定

總真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），總細(xì)菌采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。分別采用Nash和Snyder培養(yǎng)基（NS）［12］、TSB培養(yǎng)基（TSB）、Masaago培養(yǎng)基（MAS）［13］、和假單胞菌CFC選擇培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司），對土壤典型微生物類型進(jìn)行選擇培養(yǎng)。采用平板涂抹法測定各種微生物數(shù)量，換算為每克干土所含菌群數(shù)量表示。各種微生物具體采用的土壤稀釋梯度、培養(yǎng)條件見表2。

表2 用于培養(yǎng)土壤各類微生物的培養(yǎng)基、稀釋濃度及培養(yǎng)條件Table 2 Incubation condition, dilutions and media for different cultural microorganisms in soils

1.6 土壤微生物種類鑒定

由于分離、鑒定工作繁重，難以對所有樣品進(jìn)行微生物種類鑒定，本研究主要分離、鑒定花針期花生根表中各種微生物的類型。計(jì)數(shù)后，在真菌性培養(yǎng)平板上隨機(jī)挑取典型單菌落于PDA平板上培養(yǎng)，經(jīng)多次純化后轉(zhuǎn)入PDA斜面，于4℃冰箱保存。在細(xì)菌性培養(yǎng)平板上挑取單菌落，經(jīng)過平板劃線于NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1～2d，經(jīng)多次純化后轉(zhuǎn)入NA斜面，于4℃冰箱保存。純化的真菌菌株在PDA平板上活化，7d后挑取少量菌絲，液氮研磨，使用試劑盒Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA。純化的細(xì)菌菌株接種于NA液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24h，收集菌液，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA。

細(xì)菌1 6 S r D N A 采用通用引物2 7 F（5′-A G A G T T T G AT C C T G G C T C A G-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）［14］，真菌I T S 序列采用通用引物I T S 5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［15］進(jìn)行擴(kuò)增測序。4 0 μ L P C R 反應(yīng)體系包含2×MASTER Mix（20 μL）、模板DNA、正反向引物(10μmol·L-1)各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至40 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?，真菌?4℃起始變性5min，94℃變性30s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min后4℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌：94℃起始變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司分析，測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對分析。從PDA培養(yǎng)基隨機(jī)挑選21個(gè)克隆，NS培養(yǎng)基13個(gè)，MAS培養(yǎng)基9個(gè)，TSB培養(yǎng)基15個(gè)，TSA培養(yǎng)基41個(gè)，CFC培養(yǎng)基21個(gè)等用于序列分析；根據(jù)每個(gè)克隆的測序頻度計(jì)算對應(yīng)物種分檢的相關(guān)豐度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，數(shù)據(jù)處理結(jié)果用平均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示（means±SD），采用Dunnett法分析處理間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 連作對花生生長及病害發(fā)生的影響

在成熟期，輪作種植下花生莢果鮮重和生物量分別為8300 kg·hm-2、14100kg·hm-2，是連作條件下的1.89倍和1.32倍；每株平均有效根瘤數(shù)為305，高于連作134.6%。相應(yīng)的，與連作相比，輪作花生根腐病和青枯病病情指數(shù)分別降低58.7%和65.8%（圖1）。

2.2 連作和輪作種植模式下花生土壤微生物數(shù)量變化規(guī)律

圖1 連作、輪作地塊花生生長、產(chǎn)量和病害發(fā)生情況Fig. 1 Peanut growth,yield anddisease incidencerelative to cropping system, monocropping or rotation

經(jīng)典可培養(yǎng)技術(shù)方法研究表明，與輪作相比，花針期和成熟期連作花生根際微生物明顯較高，其中根表真菌數(shù)量增加83%～134%，根表細(xì)菌數(shù)量增加108%（花針期）；而對于“非根際”樣品，連作與輪作花生之間無顯著差異。尖孢鐮刀菌的分析結(jié)果表明，花針期連作和輪作花生根表其數(shù)量無顯著差異；而到結(jié)莢期，連作花生根表數(shù)量高于輪作27.2%（P＜0.05）。木霉和疫霉則在連作地塊花生“非根際”的數(shù)量均顯著低于輪作花生；而在花生“根際”和“根表”微域內(nèi)卻呈現(xiàn)出相反的趨勢，連作花生根表木霉和疫霉的數(shù)量分別較輪作花生增加390.4%～1344.1%和39.9%～76.1%。假單胞菌在“非根際”微域連作花生的數(shù)量顯著低于輪作；但在“根表”和“根際”微域連作花生顯著高于輪作，其中在“根表”區(qū)域表現(xiàn)的差異最為顯著，增幅達(dá)47.1%～227.7%（圖2）。

從不同微域花生土壤的變異來看，各類微生物均表現(xiàn)從“根表”到“根際”再到“非根際”逐漸下降趨勢，其中“根表”到“根際”下降趨勢劇烈，例如真菌數(shù)量下降64.6%～97.8%，細(xì)菌數(shù)量下降73.8%～99.7%。方差結(jié)果顯示各類微生物從“根表”到“根際”的變異程度均高于“根際”到“非根際”（表3）。

2.3 連作和輪作種植模式下花生根表可培養(yǎng)真菌群落變化

圖2 不同培養(yǎng)基下連作和輪作地塊花生根表、根際及非根際各類可培養(yǎng)微生物數(shù)量Fig. 2 Number of culturable microbes in peanut rhizoplane, rhizosphere and bulk relative to culture medium and cropping system

表3 不同微域分布的花生土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的方差比較Table 3 ANOVA of culturable microbes relative to microzonesof peanut soil

由圖3可知，青霉屬（Penicillium sp.）在輪作與連作花生根表均能鑒定到，連作中以微紫青霉菌（P. janthinellum）和Penicillium s p.2 8 B R O-2 0 1 3 為主，輪作中以微紫青霉菌和Penicillium sp. 196F為主。輪作和連作花生根際均分離出曲霉屬（As pergillu s s p.），連作中包括黑曲霉（Aspergillus niger）、煙曲霉（A. fumigatus）和Aspergillus sp. J2；輪作中包括黑曲霉、煙曲霉、Aspergillus sp. J2和Aspergillus sp. BAB-5682，其中連作中黑曲霉豐度較高。粉紅粘帚菌（Clonostachys rosea）主要在連作花生根表鑒定到，且豐度高于輪作花生。在連作花生根表鑒定到踝節(jié)屬中Talaromyces pinophilus、T. verruculosus、T. aculeatus，毛殼菌（C h a e t o m i u m s p. AT T 2 1 0），尖孢鐮刀菌（F u s a r i u m o x y s p o r u m）和小球腔菌（Leptosphaeria spegazzinii），但這些真菌類型沒有在輪作花生根表分離到，其中連作花生根表踝節(jié)屬菌豐度較高。相反，莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum var. caulivora）、毛霉菌（M u c o r s p. F B C C 2 3 1 9）、白地霉（Geotrichum candidum）、木霉菌（Trichoderma gamsii）、卵形孢球托霉（Gongronella butleri）和Didymella molleriana僅在輪作花生根表中鑒定到，其中白地霉在輪作花生根表中豐度較高（圖3）。

用于分離鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基（NS）中，除了鑒定到尖孢鐮刀菌外，還分離到青霉和白地霉等菌株。木霉選擇性培養(yǎng)基（TSB）僅分離到少量的木霉，多數(shù)屬于踝節(jié)菌和曲霉；而在疫霉選擇性培養(yǎng)基（MAS）中并未鑒定到疫霉，多數(shù)分離為粉紅粘帚菌和白地霉（圖3）。

圖3 不同培養(yǎng)基中連作和輪作花生根表可培養(yǎng)真菌（a）、細(xì)菌（b）鑒定及豐度Fig. 3 Identification of cultivable fungi (a) and bacteria (b) and their abundance in the peanut rhizoplanerelative to medium and cropping system

2.4 連作和輪作種植模式下花生根表可培養(yǎng)細(xì)菌群落變化

芽孢桿菌（B a c i l l u s s p.）、節(jié)細(xì)菌（Arthrobacter sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.）是花生根表中常見類型，其中假單胞菌在輪作花生根表中豐度更高（圖3）。連作花生根表節(jié)細(xì)菌以煙草節(jié)桿菌（A. nicotianae）、Arthrobacter sp. 95-0188、分枝節(jié)桿菌（A. ramosus）和金黃節(jié)桿菌（A. aurescens）為主，而輪作中以嗜煙堿節(jié)桿菌（A. nicotinovorans）、Arthrobacter sp. 95-0188和分枝節(jié)桿菌為主。連作中假單胞菌只有黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva），輪作中包括Pseudomonas sp. BX2、Pseudomonas koreensis和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。

在連作和輪作花生根表中均能分離到生癌腸桿菌（Enterobacter cancerogenus），且豐度差異不明顯（圖3）。連作花生根際中分離到沙雷氏菌Serratia sp. MIE2、嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）、皮氏羅爾斯通氏菌（Ralstonia pickettii）、泛菌（Pantoea sp. 57917）和紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis），其中沙雷氏菌屬（Serratia sp.）豐度較高，但這些細(xì)菌在輪作花生根表沒有鑒定到。相反，泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vesicularis）和溶淀粉類芽胞桿菌（Paenibacillus amylolyticus）均僅在輪作花生根表鑒定到（圖3）。用于分離假單胞菌的CFC培養(yǎng)基中，除了鑒定到假單胞菌外，還分離到一些沙雷氏菌、伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）和無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）等。

3 討 論

連作障礙是很多農(nóng)作物普遍存在的問題，一般連作后均有可能影響土壤的理化和生物特性，進(jìn)而影響作物生長及產(chǎn)量。本研究中連作和輪作土壤基本理化性質(zhì)無顯著性差異。同樣，研究發(fā)現(xiàn)土壤高溫滅菌可有效控制連作土壤對作物生長的影響，有的還可明顯促進(jìn)作物生長［16］，說明土壤理化因子一般不是造成連作下作物生長受限的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，與輪作花生相比，連作花生根部根瘤數(shù)量降低50%以上，進(jìn)而導(dǎo)致連作花生自身固氮能力和氮素轉(zhuǎn)化的降低［17］，這可能是引起連作地塊花生生長顯著低于輪作地塊的重要因素之一。然而，連作花生根部土傳病害發(fā)生顯著上升，這與王明珠和陳學(xué)南［18］針對紅壤區(qū)花生病害調(diào)查結(jié)果一致，說明花生連作后根系對病原菌的微生態(tài)抗性能力顯著下降。

根際效應(yīng)是植物通過根系分泌物的代謝，致使植物根際微生物種類、數(shù)量和活性顯著高于非根際土壤的現(xiàn)象［19］。而目前關(guān)于揭示土壤微生物群落失衡與作物連作障礙發(fā)生關(guān)系的研究，沒有考慮到微生物數(shù)量和種群在土壤不同微域分布。從本研究結(jié)果來看，無論連作還是輪作花生，各種微生物數(shù)量均呈現(xiàn)從“根表”到“根際”再到“非根際”逐漸下降趨勢，尤其是從“根表”到“根際”層次下降幅度更加明顯?！案怼弊鳛楦两缑?，其特定的生理代謝活性是影響根際微生物到“根表”定殖的關(guān)鍵因素。例如，Williams和Russo［20］研究發(fā)現(xiàn)根部Acidic Exopolysaccharide (EPS)基因的表達(dá)是影響根瘤菌附著大豆根表和形成生物膜的重要因素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)根部分泌甘露聚糖可以介導(dǎo)土壤微生物大量附著在大豆根部表面。Kos等［21］也發(fā)現(xiàn)微生物的自凝集作用與其附著在根表面物質(zhì)之間存在密切關(guān)系。總體而言，由于根域微生物變化與植物根系分泌物代謝特征關(guān)系密切，而根表是受根系分泌物代謝影響最為直接的部位，因此微生物數(shù)量在連作和輪作花生“根表”中差異巨大，說明“根表”附著的微生物種群結(jié)構(gòu)與植物健康最為密切相關(guān)，未來有關(guān)連作障礙的微生物生態(tài)研究應(yīng)著重于作物“根表”，因而針對連作障礙的微生物修復(fù)重點(diǎn)也應(yīng)放在作物“根表”上。

通過對比連作和輪作地塊，發(fā)現(xiàn)連作花生在“根表”和“根際”層次上的真菌和細(xì)菌數(shù)量顯著較高，而在“非根際”層次無顯著差異。與本研究結(jié)果有所不同是，一些研究發(fā)現(xiàn)連作作物根際土壤呈現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量下降、真菌數(shù)量上升的趨勢［22］。但也有研究表明連作后植物細(xì)菌數(shù)量高于輪作［23］。與“根際”相比，連作花生“根表”微生物受根系的影響及對根系的反作用明顯增強(qiáng)。這可能因?yàn)楫?dāng)根系受到病原微生物侵染發(fā)生病變時(shí)，根表組織潰爛、分泌物增多，導(dǎo)致根表上細(xì)菌、真菌數(shù)量與比例發(fā)生明顯變化。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)病原菌侵染植物根部時(shí)不僅引起根際微生物群落組成的改變，還會(huì)導(dǎo)致根際生態(tài)代謝功能的變化［10,24,25］。Wu等［26］研究結(jié)果表明相比于健康三七植株，三七病株的根際微生物總量增加，并且根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而根瘤菌作為根域微生物的重要成員，根表微生物種群的變化可能影響植物結(jié)瘤。因此，“根表”微生物數(shù)量的急劇增多及組成改變可能是引起連作花生根瘤降低、根部病害上升的重要原因。但是，“根表”細(xì)菌和真菌豐度增多與連作花生根部生理代謝功能關(guān)系及“根表”根瘤菌種群變化，還需進(jìn)一步研究。對于“非根際”土壤，由于距離根系相對較遠(yuǎn)，故而受植物根系分泌物的影響很小，但其他栽培措施可能對其影響較大，這可能是引起連作和輪作地塊花生非根際土壤微生物數(shù)量無顯著差異的原因。對此，本研究從樣品采集及分析方法上對“根表”與“根際”土進(jìn)行區(qū)別研究，有助于從更精確的微觀分析中發(fā)現(xiàn)作物連作障礙發(fā)生與微生物生態(tài)的關(guān)系。

進(jìn)一步結(jié)合分子生物學(xué)鑒定來看，相對于輪作花生，連作花生根表中踝節(jié)菌（Talaromyces sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）和粉紅粘帚菌（Clonostachys rosea）種群豐度較高。其中，黑曲霉是花生土傳性病害—冠腐病的病原菌［7］；也有研究報(bào)道踝節(jié)菌在連作太子參中大量繁殖，引起發(fā)?。?］；粉紅粘帚菌是引起大豆根腐病潛在病原菌［9］。而在輪作花生根表中豐度較高的白地霉（Geotrichum candidum），有研究發(fā)現(xiàn)其對黃瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌的防治具有顯著成效［27］。值得注意的是，在鐮刀菌選擇培養(yǎng)基（NS）中，連作和輪作花生之間的“根表”尖孢鐮刀菌數(shù)量花針期并無明顯差異，但到了花生結(jié)莢期，連作花生“根表”尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯高于輪作花生，這與收獲期連作花生根腐病發(fā)病率顯著高于輪作的結(jié)果一致，表明尖孢鐮刀菌可能是花生生長后期根腐病發(fā)生的重要病原菌。針對花生根表細(xì)菌，連作中沙雷氏菌屬豐度很高，而輪作花生根表的優(yōu)勢種群轉(zhuǎn)變成假單胞菌，說明連作花生根表有益細(xì)菌數(shù)量大幅度下降與植株生長狀況密切相關(guān)［28］。此外，在鑒定到豐度相對較低的菌株中，連作花生根表中分離到的小球腔菌（Leptosphaeria sp.）、泛菌屬（Pantoea sp.）、紅球菌（Rhodococcus sp.）和青枯雷爾氏菌（Ralstonia sp.），有報(bào)道很多與植物發(fā)病有關(guān)［29］。相反，僅在輪作花生根表分離到的木霉（Trichoderma sp.）、類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）和短波單胞菌（Brevundimonas sp.）是很多病原菌的拮抗菌，尤其木霉已作為生防菌劑進(jìn)行應(yīng)用［30］。由此可見，輪作可能通過改善花生根表微生物結(jié)構(gòu)，增加了有益/拮抗菌群的豐度，有效避免了病原菌在作物根表的定殖，從而降低了花生罹患土傳病害的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，關(guān)于土壤微生物多樣性的研究方法已從傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)向?yàn)榉肿由飳W(xué)方法，尤其是近年來高通量測序技術(shù)的普及，其一次性可以對高達(dá)數(shù)百萬的DNA分子序列進(jìn)行測定，在微生物生態(tài)研究中具有數(shù)據(jù)通量高、微生物組成多樣性豐富等優(yōu)勢［31］。同時(shí)，也面臨著海量數(shù)據(jù)分析難、測序短不能有效鑒定到“種”、數(shù)據(jù)庫中存在過多未鑒定物種以及實(shí)驗(yàn)過程步驟繁瑣等問題。本研究采用傳統(tǒng)的微生物平板分離并結(jié)合分子生物技術(shù)，單個(gè)菌株可獲得更長的基因組片段，對各分離菌株做了更為準(zhǔn)確的定位。并且，所分離到的各菌株可用于后續(xù)微生物生態(tài)功能研究，有助于進(jìn)一步揭示連作作物根部病害與微生物生態(tài)的關(guān)系。

4 結(jié) 論

花生連作后植株生長受限、根瘤數(shù)減少、土傳性病害上升，進(jìn)而導(dǎo)致花生產(chǎn)量降低。與“非根際”土壤相比，“根表”微生物受花生根系生理代謝活動(dòng)影響最大，因而與連作障礙發(fā)生關(guān)系密切，是未來連作障礙微生態(tài)發(fā)生機(jī)制研究中重點(diǎn)關(guān)注部位。連作后花生“根表”細(xì)菌和真菌種群數(shù)量持續(xù)增多，但有益型微生物的鑒定頻度降低，而病原性微生物種群豐度較高，進(jìn)而導(dǎo)致“根表”微生物生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，可能是引起連作下土傳性病害大幅上升關(guān)鍵原因。

致 謝 感謝中國科學(xué)院南京土壤研究所時(shí)玉博士在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹中的幫助！