馬泊泊 黃瑞林 張 娜 孫 波 梁玉婷?

（1 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇常州 213164）（2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

根際是土壤中植物根系受到微生物特殊影響的重要區(qū)域，該區(qū)域從主根表面延伸幾毫米，是植物-土壤-微生物相互聯(lián)系的重要場所［1-2］。根際環(huán)境中，細(xì)菌與真菌密切聯(lián)系，細(xì)菌以真菌的菌絲為通道進(jìn)入土壤基質(zhì)。腐生真菌依靠分泌的胞外酶分解利用有機(jī)質(zhì)，附著在其菌絲上的細(xì)菌也可從這個過程中獲取養(yǎng)分，從而抑制真菌的生長。細(xì)菌還可以與真菌合作，通過降解抑制真菌生長的有毒化合物或多糖，或通過固氮為真菌降解木質(zhì)纖維素提供氮進(jìn)而加快有機(jī)質(zhì)的分解速率［3］。細(xì)菌和真菌的相互作用在生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)過程中起著關(guān)鍵作用，對植物的健康生長有重要影響［4］。Toro等［5］研究植物利用低生物有效性磷源時發(fā)現(xiàn)，雙重接種叢枝菌根真菌和具有溶磷能力的枯草芽孢桿菌可顯著增加作物的生物量和氮、磷積累量，證明根際促生細(xì)菌和菌根真菌之間的相互作用促進(jìn)了營養(yǎng)元素的持續(xù)供應(yīng)。根瘤菌和菌根真菌的互作可顯著緩解半寄生植物對宿主的寄生危害［6］，此外，生活在根際環(huán)境中的木霉、芽孢桿菌等可以通過與真菌病原體產(chǎn)生拮抗作用，減少病原微生物的傳播，降低植物病害水平［7-8］。生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析法（Ecological network analysis）可以將微生物群落的相互作用關(guān)系可視化，并揭示物種在微生境中的共現(xiàn)關(guān)系及主要影響因素［9］，為解釋復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了一種新的方式。利用網(wǎng)絡(luò)分析法可以揭示土壤重要元素生物地球化學(xué)耦合過程中微生物的互作機(jī)制，是預(yù)測和改善土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的重要步驟［3］。已有報道利用網(wǎng)絡(luò)分析法探討土壤中細(xì)菌-真菌的相互作用關(guān)系，例如，Purahong等［10］使用網(wǎng)絡(luò)分析法研究了凋落物分解過程中細(xì)菌和真菌群落的交互作用模式，證明凋落物分解的不同階段是由細(xì)菌、真菌群落的變化和相互作用控制的。

生物質(zhì)炭作為改良劑是目前改善土壤肥力和固碳減排的有效方法之一［11-13］。生物質(zhì)炭以其特殊的結(jié)構(gòu)和組成，可以改善土壤的許多特性，如促進(jìn)團(tuán)聚體的形成、增加陽離子交換量、增強(qiáng)養(yǎng)分吸收能力和持水能力以及減緩過量酸化等［14-16］，在土壤改良和農(nóng)作物增產(chǎn)等方面有良好的應(yīng)用［17-18］。此外，生物質(zhì)炭本身特有的芳香化表面、良好的多孔性結(jié)構(gòu)以及極高的水肥吸附作用還可以為土壤微生物如細(xì)菌和真菌提供棲息地，增加微生物的生物量［19］。大量的研究證實(shí)，添加生物質(zhì)炭可以改變微生物的群落結(jié)構(gòu)和酶活性，這對于有機(jī)質(zhì)積累、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等土壤生態(tài)過程有著重要作用［20-23］，從而間接影響植物的生長［24-26］。盡管生物質(zhì)炭對土壤微生物的影響受到越來越多的關(guān)注，但是關(guān)于生物質(zhì)炭對微生物群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的研究存在不足，尤其是對于生物質(zhì)炭是如何影響根際土壤細(xì)菌-真菌群落相互作用的方面，仍缺乏相關(guān)研究。

水稻是世界主要糧食作物之一，種植廣泛，研究水稻土具有重要的實(shí)用意義；黑麥草是優(yōu)質(zhì)的放牧用牧草，作為主要的綠肥有一定的研究基礎(chǔ)。本研究選擇水稻土和黑麥草作為試驗(yàn)材料，通過對16S rRNA（V4-V5區(qū)）和ITS2區(qū)的高通量測序，利用生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析法構(gòu)建施加生物質(zhì)炭處理和未施加生物質(zhì)炭的條件下黑麥草根際細(xì)菌-真菌群落互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步揭示秸稈生物質(zhì)炭對根際土壤細(xì)菌-真菌群落相互作用的影響及主要驅(qū)動因素，探討生物質(zhì)炭對根際土壤細(xì)菌-真菌群落互作模式的改變及主要機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為黃棕壤，于2016年11月份采自中國江蘇省常州市（119.75°E，31.73°N），采集水稻田0～10 cm土壤（非淹水條件下），風(fēng)干后過2 cm篩并研磨粉碎備用。土壤的理化性質(zhì)：比表面積28.73 m2·g-1，微孔面積4.57 m2·g-1，外表面積24.17 m2·g-1，微孔體積0.002 cm3·g-1；pH7.65，銨態(tài)氮含量1.24 mg·kg-1，硝態(tài)氮含量0.28 mg·kg-1，有效磷含量0.34 mg·kg-1。

供試黑麥草種子來自中國江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草研究所。生物質(zhì)炭樣品由小麥秸稈在600 ℃缺氧條件下緩慢熱解8 h而成。

1.2 研究方法

試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，設(shè)置添加生物質(zhì)炭（生物質(zhì)炭按2%的比例均勻添加到盆栽土壤中）和對照（未施加生物質(zhì)炭）兩組處理。每盆裝土3 kg，種入30粒飽滿的黑麥草種子，在種苗發(fā)芽后的第0、5、10、15、20、25、30、35、40天進(jìn)行破壞性采樣，3個重復(fù)，共計(jì)54盆。

采樣時，將黑麥草從盆栽中取出，用抖落法將每盆土壤的根際土壤收集好并按要求保存，用于土壤理化性質(zhì)和根際微生物的測定（若土樣量無法達(dá)到測試要求，使用小型鐵鍬刮取根系周圍＜ 1 cm范圍的土壤）。對應(yīng)的黑麥草植株用于測定根系體表形態(tài)學(xué)參數(shù)。

土壤的p H、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有效磷的測定參考文獻(xiàn)［27］。土壤物理結(jié)構(gòu)的測定：利用TriStar II 3020全自動比表面積及孔隙度分析儀對各樣品做氮?dú)馕?、解吸試?yàn)，氮吸附在液氮溫度（77 K）下操作。分析測試前，樣品在150 ℃條件下真空（約10-2Pa）脫氣4 h，然后利用BET法［28］計(jì)算出樣品的比表面積（SBET），利用t-plot模型［29］計(jì)算微孔比表面積（Smi）和孔體積（Vmi）。植物根系的測定：將洗凈的根放入根盤內(nèi)，根據(jù)植物根系測定方法［30］，使用掃描儀( V700 Epson) 掃描完整的根系圖像存入計(jì)算機(jī)，采用WinRHIZO PRO 2007根系分析系統(tǒng)軟件分析根系總長度、平均直徑、平均長度、總表面積、總切面面積、平均表面積、平均切面面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。

1.3 DNA提取及高通量測序

稱取2 g土壤樣品，加入液氮冷凍研磨，使用Power Soil DNA isolation kit提取土壤總DNA。提取后上機(jī)檢測各樣品DNA的質(zhì)量和濃度，合格的樣品在-80℃條件下保存。利用Illumina測序平臺，對54個樣本做細(xì)菌16S rRNA（V4-V5區(qū)）和真菌（ITS2區(qū)）高通量測序，以標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌/真菌基因組DNA Mix作為陽性對照，根據(jù)選定的檢測區(qū)域確定相對應(yīng)的擴(kuò)增引物，對各樣本的檢測區(qū)域做高保真PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S rRNA（V4-V5區(qū)）擴(kuò)增引物序列為：Primer F=Illumina adapter sequence 1 + GTGCCAGCMGCCGCGG，P r i m e r R=I l l u m i n a a d a p t e r s e q u e n c e 2 +CCGTCAATTCMTTTRAGTTT；真菌（ITS2區(qū)）擴(kuò)增引物序列為：Primer F = Illumina adapter sequence 1+GCATCGATGAAGAACGCAGC，P r i m e r R=I l l u m i n a a d a p t e r s e q u e n c e 2+TCCTCCGCTTATTGATATGC。細(xì)菌16S rRNA（V4-V5區(qū)）區(qū)域擴(kuò)增的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置95 ℃、2 min；變性步驟設(shè)置94 ℃、20 s，退火步驟設(shè)置55 ℃、40 s，延伸步驟設(shè)置72 ℃、1 min，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三個步驟35次；末延伸步驟設(shè)置72 ℃、2 min。真菌（ITS2區(qū)）區(qū)域擴(kuò)增的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置94 ℃、2 min；變性步驟設(shè)置94 ℃、30 s，退火步驟設(shè)置55 ℃、30 s，延伸步驟設(shè)置72 ℃、1 min，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三個步驟25次；末延伸步驟設(shè)置72 ℃、10 min。利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR將特定的標(biāo)簽序列導(dǎo)入文庫末端。細(xì)菌樣本添加特異性標(biāo)簽序列的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置98 ℃、30 s；變性步驟設(shè)置98 ℃、10 s，退火步驟設(shè)置65 ℃、30 s，延伸步驟設(shè)置72 ℃、3 0 s，重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三個步驟11次；末延伸步驟設(shè)置72℃、5 min。真菌樣本添加特異性標(biāo)簽序列的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置94 ℃、2 min；變性步驟設(shè)置94 ℃、30 s，退火步驟設(shè)置55 ℃、30 s，延伸步驟設(shè)置72 ℃、1 min，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三個步驟8次；末延伸步驟設(shè)置72 ℃、10 min。應(yīng)用核酸純化磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到樣本的原始文庫。利用Qubit熒光定量儀對文庫精確定量，按相應(yīng)比例（摩爾比）混合樣本。通過Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀檢測混樣后的文庫插入片段的大小，確認(rèn)在120～200 bp之間無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測序文庫濃度。采用Miseq系列測序儀2×250 bp的雙端測序策略對文庫做測序。

原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾后，利用U PA R S E 軟件對其做O T U（O p e r a t i o n a l Taxonomic Unit）聚類分析，分類依據(jù)參照RDP（RibosomalDatabase Project）數(shù)據(jù)庫的RDP Release 11.5版本。細(xì)菌測序中每個樣本獲得的序列數(shù)范圍為42 534～76 867 reads，為了盡量減少樣本中讀取計(jì)數(shù)變化的影響，我們基于樣本序列最低數(shù)量（42 534 reads）對其做抽平化處理，按照97%的相似性對所有序列做OTU劃分，各樣品文庫的覆蓋率均達(dá)到98%以上。真菌測序中每個樣本獲得的序列數(shù)范圍為44 941～98 438 reads，同樣基于樣本序列最低數(shù)量（44 941 reads）對其做抽平化處理，使各樣品文庫的覆蓋率均達(dá)到98%以上，保證樣本中絕大多數(shù)序列均可被測出，因此本次測序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Illumina測序得到的細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)據(jù)，使用Cytoscape（3.5.0）軟件中的CoNet插件構(gòu)建微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。分析步驟和網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的選擇參照顧靜馨［31］提供的操作方法，網(wǎng)絡(luò)分析中，我們選擇四種相關(guān)分析方法，即Pearson correlation，Spearman correlation，Bray-Curtis dissimilarity和Kullback-Leibler dissimilarity，并設(shè)置700的起始連接數(shù)。然后，采用Benjamini-Hochberg方法標(biāo)準(zhǔn)化處理相關(guān)系數(shù)，即校正原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性P值（P-value），并最終采用校正后的P值，保留P＜0.05的相關(guān)OTU構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。利用NetworkAnalyzer工具，獲得網(wǎng)絡(luò)的特征路徑長度、連接數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、聚集系數(shù)、網(wǎng)絡(luò)密度和平均連通度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

根據(jù)中介中心性值（betweenness centrality scores）指標(biāo)的最大值確定關(guān)鍵物種［32-33］，中介中心性指的是一個節(jié)點(diǎn)擔(dān)任其他兩個節(jié)點(diǎn)之間最短路徑的橋梁的次數(shù)。網(wǎng)絡(luò)中任意兩個節(jié)點(diǎn)的所有最短路徑，如果這些最短路徑中有很多條都經(jīng)過了某個節(jié)點(diǎn)，那么就認(rèn)為這個節(jié)點(diǎn)的中介中心性高。一個節(jié)點(diǎn)充當(dāng)“中介”的次數(shù)越高，它的中介中心度就越大，說明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中承擔(dān)的角色越重要。節(jié)點(diǎn)的中介中心值可由互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)出。

分子復(fù)合物檢測（MCODE）是一種基于網(wǎng)絡(luò)密度的網(wǎng)絡(luò)模塊識別算法，首先根據(jù)節(jié)點(diǎn)所在的、最高K-core值的密度為網(wǎng)絡(luò)中的所有節(jié)點(diǎn)賦予一個權(quán)值，并選取具有最高權(quán)值的一個節(jié)點(diǎn)視作種子節(jié)點(diǎn)，依次向外擴(kuò)增，將權(quán)值在閾值之上的周邊節(jié)點(diǎn)依次納入到模塊中，直至沒有節(jié)點(diǎn)可包含到該模塊中為止。然后將選擇剩余下來的節(jié)點(diǎn)中權(quán)值最高的視作種子節(jié)點(diǎn)做同樣的操作。最后根據(jù)設(shè)定的K-core值將不滿足條件的模塊刪除。使用Cytoscape（3.5.0）軟件中的MCODE插件分析互作網(wǎng)絡(luò)中高度互連節(jié)點(diǎn)的模塊化結(jié)構(gòu)和組，所有分析參數(shù)均采用標(biāo)準(zhǔn)值，即度數(shù)截止值設(shè)為2，節(jié)點(diǎn)得分截止值設(shè)為0.2，K-core值設(shè)為2，種子最大深度設(shè)為100。使用Mantel test分析方法評估土壤結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子以及植物根系等因子對根際土壤細(xì)菌-真菌群落相互作用的影響，Mantel test在微生物領(lǐng)域常被用于計(jì)算物種組成和環(huán)境因子之間的相關(guān)性，基于Pearson相關(guān)性分析以及置換檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性P值，分析在R-studio v7.2中利用ecodist軟件包實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 施加生物質(zhì)炭對微生物互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響

基于顯著相關(guān)性對細(xì)菌和真菌的高通量測序數(shù)據(jù)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)（圖1），探究施加生物質(zhì)炭處理下根際土壤細(xì)菌-真菌群落的共現(xiàn)模式，使用NetworkAnalyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)（表1）?？梢钥闯?，施加生物質(zhì)炭對根際土壤細(xì)菌-真菌群落之間的共現(xiàn)模式產(chǎn)生重要影響，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)的分析表明，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、聚集系數(shù)、特征路徑長度、網(wǎng)絡(luò)密度和平均連通度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)在對照組和生物質(zhì)炭組之間顯著不同（P＜0.05）。對照組中，根際土壤細(xì)菌-真菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)包含44個節(jié)點(diǎn)（其中細(xì)菌節(jié)點(diǎn)數(shù)為24，真菌節(jié)點(diǎn)數(shù)為20）、112條連線（其中28.6%為正連線，71.4%為負(fù)連線）；生物質(zhì)炭組中，根際土壤細(xì)菌-真菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)包含84個節(jié)點(diǎn)（其中細(xì)菌節(jié)點(diǎn)數(shù)為62，真菌節(jié)點(diǎn)數(shù)為22）、455條連線（其中51.6%為正連線，48.4%為負(fù)連線）。施加生物質(zhì)炭后，網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)增多，且主要表現(xiàn)為細(xì)菌節(jié)點(diǎn)數(shù)的增多，網(wǎng)絡(luò)的連接數(shù)增多，正連接數(shù)占總連接數(shù)的比重增加，施加生物質(zhì)炭顯著增強(qiáng)了細(xì)菌-真菌互作網(wǎng)絡(luò)的積極聯(lián)系（P＜0.05）。與對照組相比，施加生物質(zhì)炭處理?xiàng)l件下根際土壤細(xì)菌-真菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出更高的網(wǎng)絡(luò)密度、聚集系數(shù)和平均連通度。

圖1 兩種處理下細(xì)菌-真菌共現(xiàn)模式的響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 Network of the bacterial and fungal co-occurrence pattern relative to treatment

表1 兩種處理下細(xì)菌-真菌互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)Table 1 Topological parameters of the bacterial and fungal interaction network relative to treatment

圖2展示了互作網(wǎng)絡(luò)中群落之間連接數(shù)的分布情況。對照組中，細(xì)菌-真菌群落之間的相互作用（共60個相關(guān)中有7個正相關(guān)）居于主導(dǎo)地位，顯著高于細(xì)菌群落內(nèi)部（共38個相關(guān)中有18個正相關(guān)）以及真菌群落內(nèi)部（共14個相關(guān)中有7個正相關(guān)）的相互作用。施加生物質(zhì)炭處理?xiàng)l件下，群落間相互作用加強(qiáng)，細(xì)菌群落內(nèi)部相互作用（共311個相關(guān)中有195個正相關(guān)）增加得更為明顯，顯著高于細(xì)菌-真菌群落之間（共132個相關(guān)中有32個正相關(guān)）以及真菌群落內(nèi)部（共12個相關(guān)中有8個正相關(guān)）的相互作用。施加生物質(zhì)炭處理后，細(xì)菌群落內(nèi)部以及細(xì)菌-真菌群落之間的積極聯(lián)系顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。

圖2 兩種處理下互作網(wǎng)絡(luò)中相互作用的分布餅狀圖Fig. 2 Pie chart of the distribution of interactions in the interaction network relative to treatment

2.2 施加生物質(zhì)炭對關(guān)鍵類群和網(wǎng)絡(luò)模塊化的改變

根據(jù)中介中心性值指標(biāo)的最大值確定了關(guān)鍵物種。網(wǎng)絡(luò)分析的中介中心性指標(biāo)顯示（圖1），對照組中介中心性指標(biāo)的總體分布為0～0.27，其中起到關(guān)鍵連接作用的類群有細(xì)菌中的孫修勤菌（Sunxiuqinia）和真菌中的畢赤酵母（Pichia），中介中心性值分別為0.1 4 5 和0.1 6 4。生物質(zhì)炭組中介中心性指標(biāo)的總體分布為0 ～0.3 2，其中起到關(guān)鍵作用的類群為細(xì)菌中的黃桿菌（Flavobacterium），中介中心性值為0.131。

圖3 兩種處理下互作網(wǎng)絡(luò)MCODE分析的子網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Subnetwork diagram of the interaction network based on MCODE analysis relative to treatment

MCODE分析兩種處理下的互作網(wǎng)絡(luò)，均發(fā)現(xiàn)存在兩個具有高度互連節(jié)點(diǎn)的顯著聚類（圖3）。對照組中，得到的子網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)分別為3.5（節(jié)點(diǎn)數(shù)為9，連接數(shù)為14）和2.75（節(jié)點(diǎn)數(shù)為9，連接數(shù)為11），且均以細(xì)菌節(jié)點(diǎn)和負(fù)相互作用為主。生物質(zhì)炭組中，得到的子網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)分別為12.4（節(jié)點(diǎn)數(shù)為16，連接數(shù)為93）和8.429（節(jié)點(diǎn)數(shù)為15，連接數(shù)為59），且均以正相互作用為主。關(guān)鍵類群中的畢赤酵母（Pichia）和黃桿菌（Flavobacterium）分別出現(xiàn)在對照和施加生物質(zhì)炭處理的得分最高的模塊化結(jié)構(gòu)中。

2.3 施加生物質(zhì)炭對環(huán)境因素影響細(xì)菌-真菌群落相互作用的改變

利用Mantel test分析對照組和生物質(zhì)炭組中植物根系（根系總長度、平均直徑、平均長度、總表面積、總切面面積、平均表面積和平均切面面積）、土壤物理結(jié)構(gòu)（比表面積、微孔面積、外表面積和微孔體積）以及土壤環(huán)境因子（pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有效磷）對根際土壤細(xì)菌-真菌之間相互作用（互作網(wǎng)絡(luò)中正連接數(shù)與總連接數(shù)的比值）的影響（表2）。在對照組中，物理結(jié)構(gòu)（r=0.318，P=0.001）對細(xì)菌-真菌之間相互作用表現(xiàn)出顯著影響。施加生物質(zhì)炭后，環(huán)境因子對細(xì)菌-真菌互作的影響顯著改變，土壤pH（r=0.385，P=0.003）和土壤銨態(tài)氮（r=0.501，P=0.0 0 3）對細(xì)菌-真菌互作的影響顯著增強(qiáng)。

3 討 論

3.1 生物質(zhì)炭對共現(xiàn)模式的影響

本研究通過構(gòu)建細(xì)菌-真菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)（圖1），探討了施加生物質(zhì)炭對根際土壤細(xì)菌-真菌共現(xiàn)模式的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物共現(xiàn)模式在施加生物質(zhì)炭后顯著改變（表1），相比于未施加生物質(zhì)炭的對照組，施加生物質(zhì)炭后細(xì)菌與真菌之間的相互作用顯著增多，互作網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)顯著增多，網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜，這與Gundale和DeLuca［34］的研究結(jié)果相照應(yīng)——添加生物質(zhì)炭可以通過改變理化性質(zhì)（如pH和持水能力等）來提高土壤養(yǎng)分有效性。通常，我們認(rèn)為生態(tài)系統(tǒng)中的有效養(yǎng)分越豐富，微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和穩(wěn)定性也越高，群落的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素［35］。此外，生物質(zhì)炭的特殊孔隙結(jié)構(gòu)對細(xì)菌和真菌有保護(hù)作用，能夠降低競爭者對它們的侵害。本研究中，Mantel test分析（表2）結(jié)果表明，施加生物質(zhì)炭后，土壤pH（r=0.385，P = 0.003）和銨態(tài)氮（r=0.501，P=0.003）對細(xì)菌-真菌互作的影響顯著增強(qiáng)，與Lauber等［36］的pH是調(diào)節(jié)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最重要參數(shù)，而真菌群落與營養(yǎng)狀況關(guān)系最為密切的假設(shè)一致，認(rèn)為土壤酸度的改變有利于細(xì)菌的生長，而銨態(tài)氮的變化導(dǎo)致了真菌群落的改變，從而影響互作網(wǎng)絡(luò)。施加生物質(zhì)炭還能夠促進(jìn)黑麥草根系的生長，增加其生物量，同時，增強(qiáng)的根系產(chǎn)生的分泌物又可以為微生物的代謝和生長提供營養(yǎng)和能量，改變根際微生物與植物之間的聯(lián)系，從而改變根際土壤微生物的種類和數(shù)量。

對照組的互作網(wǎng)絡(luò)中，在細(xì)菌和真菌群落內(nèi)部以及細(xì)菌和真菌之間的相互作用以負(fù)相關(guān)關(guān)系為主（圖2），表明細(xì)菌和真菌對資源存在著潛在的競爭［37］。但是，隨著生物質(zhì)炭的施加，分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)改變，并且相互作用以正相關(guān)關(guān)系為主，尤其是細(xì)菌-真菌群落之間負(fù)相互作用的占比降低，這與Banerjee［38］的研究發(fā)現(xiàn)相似，添加有機(jī)物和營養(yǎng)物質(zhì)后，細(xì)菌-真菌互作網(wǎng)絡(luò)的正相互作用增強(qiáng)，細(xì)菌、真菌模塊內(nèi)部和細(xì)菌-真菌群落之間的負(fù)相關(guān)數(shù)量減少，這可能是因?yàn)樯镔|(zhì)炭或者有機(jī)物及營養(yǎng)物質(zhì)的添加豐富了群落的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，緩解了競爭。

3.2 生物質(zhì)炭對網(wǎng)絡(luò)模塊化結(jié)構(gòu)的影響

土壤生態(tài)系統(tǒng)中，模塊化分析對于識別樣本之間的微生物關(guān)聯(lián)、提高其與非生物因素的相互作用的理解是非常重要的。MCODE分析兩種處理下的互作網(wǎng)絡(luò)，均發(fā)現(xiàn)存在兩個具有高度互連節(jié)點(diǎn)的顯著聚類，相比于對照組，施加生物質(zhì)炭處理?xiàng)l件下互作網(wǎng)絡(luò)的模塊化結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，具有更高的網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)和更多的節(jié)點(diǎn)及相互作用，且均以細(xì)菌節(jié)點(diǎn)居多。這些模塊并非嚴(yán)格遵循分類學(xué)分類，即微生物之間存在相互作用但不依賴于它們的分類，類似地，Burke等［39］對細(xì)菌群落組裝的研究發(fā)現(xiàn)，樣本間微生物物種的組成存在較大的差異，但其功能的相似性高達(dá)70%，證明了細(xì)菌群落的組裝是由功能基因而非物種分類決定的，并提出具有相似營養(yǎng)物質(zhì)或其他生態(tài)特性的物種能夠占據(jù)相同的生態(tài)位的觀點(diǎn)。本研究中，生物質(zhì)炭的添加重新分配了系統(tǒng)資源是導(dǎo)致模塊化模式改變的可能原因。

關(guān)鍵類群是微生物群落中高度連接的類群，具有特殊而重要的作用，它們的去除可引起群落結(jié)構(gòu)和功能的急劇變化。Banerjee［38］研究證實(shí)土壤有機(jī)質(zhì)分解率由關(guān)鍵類群（細(xì)菌中的酸桿菌門、弗拉特氏菌屬和芽單胞菌屬以及真菌中的毛殼菌屬和鐮刀菌屬等）的豐度決定，并且在此前的研究中，Li等［40］發(fā)現(xiàn)在有機(jī)質(zhì)含量高的土壤中，芽單胞菌門和酸桿菌門具有較高的豐度，Harreither等［41］證實(shí)子囊菌門的毛殼菌屬在降解纖維素、纖維二糖和木質(zhì)素等有機(jī)質(zhì)方面起著關(guān)鍵作用，這不僅支持了關(guān)鍵類群對于特定生境和過程的重要性，而且為關(guān)鍵類群與微生物群落功能的相關(guān)性提供了證據(jù)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵類群中的畢赤酵母（Pichia）和黃桿菌（Flavobacterium）分別出現(xiàn)在對照和施加生物質(zhì)炭處理的得分最高的模塊化結(jié)構(gòu)中，這可能說明關(guān)鍵類群在模塊化結(jié)構(gòu)中同樣發(fā)揮重要的連接作用。

然而，這些共現(xiàn)模式是統(tǒng)計(jì)上確定的各種OTU的相對豐度之間的關(guān)聯(lián)，僅能指示潛在的正相互作用或負(fù)相互作用。在田間條件下，這些相互作用是否會發(fā)生在微觀尺度上需要進(jìn)一步的有針對性的研究，并且未來將增加實(shí)驗(yàn)來加強(qiáng)關(guān)于網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化和機(jī)制的研究。

4 結(jié) 論

施加生物質(zhì)炭顯著豐富了黑麥草根際土壤細(xì)菌-真菌群落的網(wǎng)絡(luò)相互作用，加強(qiáng)了細(xì)菌內(nèi)部以及細(xì)菌與真菌之間的積極聯(lián)系。由于網(wǎng)絡(luò)分析僅能指示微生物潛在的相互作用，同時，生物質(zhì)炭、植被以及土壤的類型，生物質(zhì)炭的添加量以及培養(yǎng)時間等因素都可能影響生物質(zhì)炭與土壤根際土壤細(xì)菌-真菌群落相互作用的關(guān)系，下一步的研究將考慮上述影響。