李小玲，華智銳，許 肖

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)又名山茶根，別名為土金茶根，藥用歷史悠久，與丹參、連翹、桔梗、五味子并稱為中國秦嶺五大商藥[1]，具有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)血脂和抗艾滋病病毒等功效[2]，主產(chǎn)于河北、遼寧、陜西、山東、內(nèi)蒙古及黑龍江等地。近年來，黃芩作為藥材被廣泛用于治療臨床各種疾病，市場對于藥用黃芩的需求量大大增加，人們過度采挖造成野生黃芩越來越少，已不能滿足市場的需求。因此，人工栽培品種成為藥用黃芩的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩生長發(fā)育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中干旱是制約黃芩產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一[3]。干旱脅迫可導(dǎo)致植物細胞內(nèi)積累大量活性氧，引起膜脂過氧化，導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著增加，嚴重破壞細胞膜和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能[4]，從而影響黃芩的生長發(fā)育，制約黃芩產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，近年來關(guān)于植物的抗旱生理研究備受關(guān)注[5-6]，同時也對植物的抗旱性提出了新的要求。研究植物抗旱機制時發(fā)現(xiàn)，通過外施某種引發(fā)劑可以提高植物的抗旱性。

種子引發(fā)是基于種子萌發(fā)生物學(xué)機制提出的一種種子處理技術(shù)[7]，其優(yōu)點是可以促進種子萌發(fā)、打破種子休眠、增加種子活力、提高種子發(fā)芽潛力、提高幼苗抗性、改善營養(yǎng)狀況[8]。研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的種子引發(fā)劑能夠提高種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢；提高幼苗的葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量；提高幼苗的過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性[9]。如低濃度的NaCl和Na2SO3引發(fā)劑可以促進干旱脅迫下少花蒺藜草及鹽蒿種子的萌發(fā)，提高種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，緩解干旱脅迫對植物的傷害，降低MDA含量，提高葉片SOD、POD、CAT活性及葉綠素含量[10-11]。目前，關(guān)于植物種子引發(fā)的研究主要集中在農(nóng)作物[12-13]、蔬菜[14-15]、黃芪[16]、桔梗[17]、白花蛇舌草[18]等，在藥用植物黃芩上的報道很少，種子引發(fā)對黃芩幼苗耐旱性的影響目前也尚未見報道。前期研究表明，采用20% PEG-6000處理黃芩可以模擬干旱環(huán)境[5-6]。基于此，以商洛黃芩為材料，探討了單引發(fā)劑(NaCl、Na2SO3、CaCl2)和復(fù)合引發(fā)劑(NaCl、Na2SO3、CaCl2不同配比濃度)對黃芩種子萌發(fā)和幼苗耐旱性的生理效應(yīng)，旨在尋找適宜黃芩的種子引發(fā)劑，為干旱地區(qū)種植黃芩提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試黃芩種子及幼苗于2018年4月初購自商洛市洛南縣藥材種植基地。NaCl、CaCl2和Na2SO3為分析純試劑(含量≥99.5%)，購自陜西晶博生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子引發(fā)處理 選取大小一致、飽滿成熟的黃芩種子(千粒質(zhì)量約10.5 mg)，用3% H2O2消毒5 min，經(jīng)蒸餾水反復(fù)沖洗后，擦干其表面水分備用。采用紙上發(fā)芽床法，在洗凈、烘干的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中鋪雙層濾紙，并加入相應(yīng)的引發(fā)溶液和20%PEG-6000，共計11個引發(fā)處理，具體見表1。各取預(yù)處理備用的黃芩種子42粒整齊地放入培養(yǎng)皿中，以加入等量蒸餾水(CK1)和20% PEG-6000溶液(干旱脅迫，CK2)分別作為對照,置入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)晝/夜為25 ℃/18 ℃，相對濕度為75%，光照強度為200 μmol/(m2·s),光周期晝/夜為14 h/10 h。每個處理重復(fù)3次，24 h后繼續(xù)噴灑20% PEG-6000及相應(yīng)的種子引發(fā)劑，并及時補水，每天觀察其生長狀況，5 d后觀察并記錄種子的發(fā)芽勢，7 d后觀察并記錄發(fā)芽率。

表1 黃芩種子及幼苗引發(fā)處理Tab.1 Priming treatment settings for seeds and seedlings of Scutellaria baicalensis

1.2.2 黃芩幼苗引發(fā)處理 幼苗試驗共設(shè)蒸餾水(CK1)、20% PEG-6000(干旱脅迫，CK2)2個對照以及11個引發(fā)處理(表1),11個引發(fā)處理同時采用20% PEG-6000進行干旱脅迫。選取長勢基本相同的1年生黃芩幼苗，均勻分配于39個規(guī)格為15 cm×18 cm的花盆中栽培并標(biāo)上序號，每盆3株，每天早上8：00給黃芩幼苗葉片正反面噴施蒸餾水、單引發(fā)劑、復(fù)合引發(fā)劑及20% PEG-6000，并于12：00進行澆水(防止水分過分流失造成黃芩幼苗死亡)，連續(xù)噴施7 d后取樣測定幼苗生理指標(biāo)。

1.3 測定項目

種子萌發(fā)指標(biāo)測定參照王治江等[19]的方法，每天記錄種子的萌發(fā)狀態(tài)，計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=(7 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，發(fā)芽勢=(5 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

可溶性蛋白含量測定參照張志良等[20]的考馬斯亮藍G-250法；MDA含量測定參照潘瑞熾[21]的硫代巴比妥酸法；脯氨酸含量測定參照王立紅等[22]的茚三酮法；POD活性測定參照朱廣廉[23]的愈創(chuàng)木酚顯色法；葉綠素含量測定參照李合生[24]丙酮-碳酸鈣法；CAT活性測定參照郝再彬等[25]的紫外吸收法；SOD活性測定參照高俊鳳[26]的氮藍四唑(NBT)光還原法。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

所有處理每次測定重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為3次測定值的平均值，用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 引發(fā)劑對黃芩種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響

從表2可以看出，與正常處理(CK1)相比，干旱脅迫(CK2)下黃芩種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低，其中，發(fā)芽勢降低60.35%、發(fā)芽率降低56.77%。0.4% NaCl處理(T1)、10 mmol/L Na2SO3處理(T2)、20 mmol/L CaCl2處理(T3)的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均較CK2顯著提高，T1處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK2分別增加39.66%和29.34%，T2處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK2分別增加43.72%和39.89%， T3處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK2分別增加120.47%和103.66%。T1與T2處理發(fā)芽勢無顯著差異，但與CK2相比均達到顯著水平(P<0.05)?？梢?，3種單引發(fā)劑處理相比，T3處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較干旱脅迫(CK2)增幅最大，說明單引發(fā)劑以20 mmol/L CaCl2緩解干旱脅迫不良影響的效果最佳。

表2 單引發(fā)劑對黃芩種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響Tab.2 Effect of single initiator on germination rate and vigor of Scutellaria baicalensis Georgi

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05),the same below.

從表3可知，當(dāng)加入不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后，與CK2相比，各處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率均有所增加，其中，T4處理黃芩種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，較CK2分別增加97.91%和86.94%；T6處理黃芩種子的發(fā)芽率最低(19.13%)，但仍較CK2增加4.54%；T8處理黃芩種子的發(fā)芽勢最低(17.15%)，但仍較CK2增加15.88%。T6、T9、T10處理間發(fā)芽率差異不大；T5、T6、T7、T9、T10處理間發(fā)芽勢無顯著差異，但均較CK2顯著提高。可見，0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理(T4)可顯著提高干旱脅迫下黃芩種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。

表3 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響Tab.3 Effect of complex initiator on germination rate and vigor of Scutellaria baicalensis Georgi

2.2 引發(fā)劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響

植物體內(nèi)的保護酶系能夠清除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。但在干旱條件下，植物體內(nèi)積累大量的活性氧最終會影響膜的通透性。從表4、表5可以看出，干旱脅迫下(CK2)黃芩幼苗體內(nèi)SOD、CAT、POD活性較對照(CK1)顯著降低，當(dāng)噴施一定量的引發(fā)劑后黃芩幼苗保護酶系活性均有所提高。

從表4可知，干旱脅迫下(CK2)，黃芩幼苗的SOD、CAT、POD活性均較對照(CK1)顯著降低，噴施不同的單引發(fā)劑后，黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性均較CK2顯著上升。0.4%NaCl處理(T1)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加41.75%、82.24%、80.29%；10 mmol/L Na2SO3處理(T2)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加26.25%、25.98%、34.31%；20 mmol/L CaCl2處理(T3)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加32.64%、54.19%、44.53%。其中，T2處理POD活性與CK1無顯著差異，但顯著高于CK2?？梢姡?種單引發(fā)劑相比， T1處理的增幅最大，說明噴施0.4% NaCl處理緩解干旱脅迫的不良影響效果最佳，黃芩體內(nèi)SOD、CAT、POD活性相對較高，可顯著降低黃芩體內(nèi)活性氧的積累，從而減輕對細胞的傷害。

表4 單引發(fā)劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響 Tab.4 Effects of single initiator on activities of SOD,CAT and POD in Scutellaria baicalensis seedlings

從表5可知，噴施不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后，黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性均較CK2顯著增加。其中，以復(fù)合引發(fā)劑0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理(T8)效果最佳，SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加34.42%、64.80%、65.69%，可見，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片中SOD、CAT、POD的活性。

表5 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響Tab.5 Effect of complex initiator on activities of SOD,CAT and POD in Scutellaria baicalensis seedlings

2.3 引發(fā)劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響

從圖1可以看出，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗葉綠素含量較CK1降低46.22%，噴施不同單引發(fā)劑后，黃芩幼苗葉綠素含量明顯上升，具體表現(xiàn)為T1、T2、T3處理較CK2分別增加147.75%、121.35%、107.30%。綜合分析認為，3種單引發(fā)劑中以0.4%NaCl處理緩解干旱脅迫不良影響的效果最佳，葉綠素含量增幅最大。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),the same below圖1 單引發(fā)劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of single initiator on chlorophyll content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖2可知，噴施不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后，黃芩幼苗的葉綠素含量均較CK2顯著增加，其中，T8處理黃芩幼苗的葉綠素含量最高(3.82 mg/g)，較CK2增加114.61%；T11處理黃芩幼苗的葉綠素含量最低(2.32 mg/g)，但仍較CK2增加30.34%；CK1與T5處理間無顯著差異，但均顯著高于CK2(P<0.05)?？梢?，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2(T8處理)可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗的葉綠素含量。

圖2 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of complex initiator on chlorophyll content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.4 引發(fā)劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

由圖3可知，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗的脯氨酸含量較CK1顯著降低，當(dāng)噴施不同單引發(fā)劑后黃芩幼苗的脯氨酸含量增加，具體表現(xiàn)為T1、T2、T3處理較CK2分別增加166.47%、72.36%、112.84%。3種單引發(fā)劑相比，T1處理增幅最大，說明單引發(fā)劑中0.4% NaCl處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最高，緩解干旱脅迫的效果最佳。

圖3 單引發(fā)劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of single initiator on proline content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖4可知，噴施不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后黃芩幼苗的脯氨酸含量均較CK2顯著增加，其中，T8處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最高(16.34 μg/g)，較CK2增加146.83%；T11處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最低，但仍較CK2增加8.76%。綜上，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2(T8處理)可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗的脯氨酸含量。

圖4 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of complex initiator on proline content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.5 引發(fā)劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響

從圖5可以看出，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗的可溶性蛋白含量較CK1顯著降低，噴施不同單引發(fā)劑后黃芩幼苗的可溶性蛋白含量增加，具體表現(xiàn)為0.4% NaCl(T1)、10 mmol/L Na2SO3(T2)、20 mmol/L CaCl2(T3)處理較CK2分別增加182.47%、101.30%、130.52%。3種單引發(fā)劑相比，T1增幅最大，說明單引發(fā)劑處理中以0.4%NaCl緩解干旱脅迫效果最佳，黃芩葉片中可溶性蛋白含量與其他處理相比最高。

圖5 單引發(fā)劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of single initiator on soluble protein content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖6可知，與CK1相比，干旱脅迫下(CK2)黃芩幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，當(dāng)噴施不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后黃芩幼苗葉片的可溶性蛋白含量均增加，增幅均達到顯著水平(P<0.05),且在T8時黃芩幼苗葉片的可溶性蛋白含量達到最大值(1.52 mg/g)，較CK2增加146.75%，效果最明顯。而T9與T10處理之間無顯著差異，但與CK2相比均達到顯著水平(P<0.05)。結(jié)果表明，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片中可溶性蛋白的含量。

圖6 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of complex initiator on soluble protein content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.6 引發(fā)劑對黃芩幼苗MDA含量的影響

從圖7可看出，干旱脅迫(CK2)下，黃芩幼苗MDA含量較CK1顯著升高；噴施不同的單引發(fā)劑后黃芩幼苗MDA含量降低，具體表現(xiàn)為T1、T2、T3處理較CK2分別降低65.94%、54.38%、59.71%。3種單引發(fā)劑相比，T1處理黃芩幼苗MDA含量降幅最大，說明單引發(fā)劑中以0.4% NaCl處理緩解干旱脅迫的效果最佳，MDA含量最低。

從圖8可知， 噴施不同配比濃度的復(fù)合引發(fā)劑后，干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量均顯著降低,其中，T8處理黃芩幼苗MDA含量最低(5.62 nmol/g)?？梢?，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著降低干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量。

圖7 單引發(fā)劑對黃芩幼苗MDA含量的影響Fig.7 Effect of single initiator on malondialdehyde content of Scutellaria baicalensis seedlings

圖8 復(fù)合引發(fā)劑對黃芩幼苗MDA含量的影響Fig.8 Effect of complex initiator on malondialdehyde content of Scutellaria baicalensis seedlings

3 結(jié)論與討論

在正常情況下，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)及各項調(diào)節(jié)機能維持著一個相對平衡的狀態(tài)。當(dāng)受到外界逆境脅迫后，其各項調(diào)節(jié)功能遭到破壞，嚴重時會影響植物的生長發(fā)育。本研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下，黃芩幼苗的可溶性蛋白、葉綠素、脯氨酸含量明顯降低，保護酶活性也受到嚴重影響。

黃芩種子在干旱環(huán)境下的萌發(fā)特性是決定黃芩能否在干旱脅迫下成功栽培的關(guān)鍵因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫降低了黃芩種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，當(dāng)外施一定濃度的單引發(fā)劑和復(fù)合引發(fā)劑后，黃芩種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均有明顯提高，這與何軍等[16]的研究結(jié)果相似。從試驗結(jié)果可以看出，單引發(fā)劑20 mmol/L CaCl2處理和復(fù)合引發(fā)劑0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最好。說明一定濃度的引發(fā)劑可以打破種子的休眠狀態(tài)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓平衡，促進種子的呼吸作用，提高體內(nèi)的調(diào)節(jié)酶活性，促進植物種子的萌發(fā)，使種子的發(fā)芽速度和整齊度得到根本改善[27]。

MDA含量是植物細胞膜脂過氧化程度的體現(xiàn)，一般情況下，MDA含量越高說明植物細胞膜脂過氧化程度越高，細胞受到的傷害越大。本研究表明，干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量明顯升高，加入不同引發(fā)劑后MDA含量明顯下降，其中，單引發(fā)劑中以0.4% NaCl處理黃芩幼苗MDA含量最低；復(fù)合引發(fā)劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，黃芩幼苗MDA含量低于其他復(fù)合引發(fā)劑處理，這與王治江等[19]的研究結(jié)果一致。由此可見，一定濃度的引發(fā)劑能夠抑制膜脂過氧化，減輕對細胞的損傷，從而提高植物的耐旱性。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，葉綠素含量的高低直接決定植物光合作用能力的高低，同時也是評判植物耐旱能力的重要指標(biāo)。脯氨酸和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增強植物保持水分的能力，保證植物的正常代謝。本試驗結(jié)果表明，單引發(fā)劑中以0.4% NaCl處理效果最佳，黃芩幼苗葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量最高；采用復(fù)合引發(fā)劑處理黃芩幼苗，其中以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，黃芩幼苗葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量較其他復(fù)合引發(fā)劑處理高；2種引發(fā)劑相比較，以單引發(fā)劑處理黃芩幼苗效果最好?？梢姡欢舛鹊囊l(fā)劑可以提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量，這與馬超等[13]的研究結(jié)果相似。

在正常生理狀態(tài)下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除保持著相應(yīng)的動態(tài)平衡，當(dāng)遭受到逆境脅迫時這個平衡被破壞，此時植物體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)會起到一定的抵抗作用，其中SOD是將氧自由基分解為H2O2和水的關(guān)鍵酶[1]，CAT和POD起協(xié)同作用，共同作用清除體內(nèi)的H2O2。本研究表明，單引發(fā)劑中以0.4% NaCl處理效果最佳，復(fù)合引發(fā)劑處理黃芩幼苗以0.4%NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，2種引發(fā)劑相比較以單引發(fā)劑處理效果最好，黃芩幼苗保護酶活性最高，表明一定的引發(fā)劑可提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片的保護酶活性。

本研究結(jié)果表明，施用不同的引發(fā)劑可以不同程度地緩解干旱脅迫對黃芩種子和幼苗所造成的傷害。單引發(fā)劑處理種子以20 mmol/L CaCl2效果最好，復(fù)合引發(fā)劑處理種子以0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2效果最佳，2種引發(fā)劑相比以單引發(fā)劑處理效果較佳。單引發(fā)劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl效果最佳，復(fù)合引發(fā)劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2效果最佳，2種處理比較以0.4% NaCl處理效果較佳，黃芩幼苗的葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸含量以及SOD、POD、CAT活性均高于其他引發(fā)劑處理。