段光前，李碩碩，李鑫，黃開耀

裂殖壺菌高產(chǎn)油突變體的高通量篩選

段光前1,2，李碩碩3，李鑫3，黃開耀1

1 中國科學(xué)院水生生物研究所 中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3 武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023

二十二碳六烯酸 (DHA) 具有促進(jìn)嬰幼兒大腦和視網(wǎng)膜發(fā)育等多種生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和養(yǎng)殖等行業(yè)。為了獲得適合于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)油、高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌工程株，文中建立了一套操作簡單、快速準(zhǔn)確的基于尼羅紅染色的高通量篩選方案。首先利用紫外線 (UVC) 誘變的方式快速構(gòu)建裂殖壺菌的隨機(jī)突變體庫。然后采用優(yōu)化后的篩選條件如裂殖壺菌的最佳尼羅紅染色條件 (二甲基亞砜濃度為20%，尼羅紅終濃度為2.0 μg/mL，孵育時間為10 min，孵育溫度為40 ℃) 和更合理的篩選依據(jù) (多功能酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)高通量測量的單位細(xì)胞密度油脂量) 等，對3 648株突變體進(jìn)行篩選，得到了3株高產(chǎn)油突變體 (D03432、D05106和D01521)。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，這3株突變體在生物量、油脂含量和DHA產(chǎn)量上均高于野生型菌株，其中突變體D03432和D05106的油脂量分別達(dá)到了干重的64.74%和63.13%，遠(yuǎn)高于野生型菌株的43.19%。而且這兩株突變體的DHA產(chǎn)量分別是野生型菌株的2.26倍和2.37倍。最后，對突變體D03432和D05106進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，相較于野生型菌株，這兩株突變體不僅生物量和油脂含量有所增加，而且DHA產(chǎn)量更是分別增加了45.51%和66.46%，展現(xiàn)出較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。此外，本篩選方案對其他產(chǎn)油微生物高產(chǎn)油突變體的高通量篩選具有借鑒作用。

油滴，高通量選育，二十二碳六烯酸 (DHA)，尼羅紅染色

二十二碳六烯酸 (All-cis-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic acid, DHA) 屬于ω-3多不飽和脂肪酸，作為一種重要的營養(yǎng)成分，因具有多種生理功能如維持嬰幼兒視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[1]、預(yù)防多種心血管疾病的發(fā)生[2]等而備受關(guān)注。隨著人們健康意識的日益增強(qiáng)，富含DHA的高質(zhì)量油脂的需求和市場與日俱增[3]。傳統(tǒng)DHA來源是深海魚油，但其可利用性、安全性和可持續(xù)性越來越受到諸多因素的挑戰(zhàn)，如魚類資源過度捕撈、海洋環(huán)境污染嚴(yán)重和高昂的純化成本等[4-5]。為了克服這些限制，人們早在1990年就開始嘗試?yán)靡恍┖Ｑ笳婧宋⑸锶缙颇覊鼐鷖p.和裂殖壺菌sp.等，并借助生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)了富含DHA油脂的工業(yè)化生產(chǎn)[6-7]。

為了進(jìn)一步提高裂殖壺菌的DHA產(chǎn)量和降低富含DHA油脂的生產(chǎn)成本，科研工作者們做了多方面的研究，主要集中在以下方面：1) 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，如采用混合型碳源 (葡萄糖和甘油)[8]、不同種類氮源的添加與限量[9-10]、添加DHA合成的前體物質(zhì)和加強(qiáng)能量供應(yīng) (蘋果酸和乙醇[11]，丙基沒食子酸和丁基苯甲醇[12]的添加) 以及利用不同工業(yè)生產(chǎn)中的廉價副產(chǎn)物或廢料 (粗甘油[13]，廢番茄汁和廢糖水[14]以及燒酒蒸餾廢水[15]) 作為發(fā)酵培養(yǎng)基等方法；2) 調(diào)控發(fā)酵過程參數(shù)，如利用在線監(jiān)測的溶氧數(shù)據(jù)并結(jié)合發(fā)酵動力學(xué)理論，總結(jié)氧傳質(zhì)系數(shù)變化的規(guī)律，進(jìn)而制定不同的氧供應(yīng)策略，從而實(shí)現(xiàn)DHA的增產(chǎn)[16-17]；3) 改進(jìn)發(fā)酵方式，早期主要是采用分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵的發(fā)酵方式[18-20]生產(chǎn)富含DHA油脂，雖然這種發(fā)酵方式具有操作簡單、污染率低和體系成熟的優(yōu)勢，但是也存在明顯劣勢如發(fā)酵批次差異性大、單位體積產(chǎn)率低和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[21]。后來發(fā)展的連續(xù)發(fā)酵雖能有效提高容積產(chǎn)率、設(shè)備利用率以及產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，但常以犧牲產(chǎn)品的濃度或轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為代價[22]，Guo等研究提出的多階段連續(xù)發(fā)酵策略有望避免這些缺陷[21]。然而，在裂殖壺菌遺傳改造和優(yōu)良菌株的選育方面鮮有報道。由于基因組信息的匱乏，以及DHA合成機(jī)制的不完善，外加沒有成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對裂殖壺菌遺傳改造也只是停留在含有單個內(nèi)源或外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化上[23-24]，而且存在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不穩(wěn)定的問題，關(guān)鍵是轉(zhuǎn)化子的DHA產(chǎn)量并無明顯提升。另外，在優(yōu)良菌株選育上，利用持續(xù)的環(huán)境壓力如高氧[4]、高鹽[25]對菌株進(jìn)行馴化，雖然能部分增加DHA產(chǎn)量，但是馴化周期過長，不適合作為大規(guī)模選育策略。因此，低成本、高通量的高產(chǎn)油 (富含DHA) 突變體的篩選方案，對實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌株大規(guī)模選育是迫切需要的。

尼羅紅 (Nile red, NR) 是一種脂溶性的熒光染料，能與細(xì)胞內(nèi)中性油脂結(jié)合并發(fā)出熒光，而且熒光的強(qiáng)度與中性油脂量存在線性相關(guān)，故可用于中性油脂含量的檢測[26]。NR染色法檢測中性油脂相較于傳統(tǒng)油脂檢測方法更為簡單、省時，結(jié)合熒光檢測儀器如酶標(biāo)儀[27]、流式細(xì)胞儀[28]的使用，可顯著提高檢測效率，已被應(yīng)用于多種細(xì)胞的中性油脂檢測，如哺乳動物細(xì)胞[29]、細(xì)菌[30]、酵母[31]和微藻[32]等。因此，可以選用NR染色法并結(jié)合多功能酶標(biāo)儀來高通量檢測裂殖壺菌染色熒光，從而判斷裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量高低。

鑒于此，本著低成本、高通量和操作簡單的原則，設(shè)計出此套篩選方案：1) 以裂殖壺菌SR21 (曾被命名為SR21[33]) 作為出發(fā)菌株，并利用紫外線 (UVC) 誘變的方式來快速構(gòu)建隨機(jī)突變體庫；2) 突變體培養(yǎng)于96孔板一段時間后，利用多功能酶標(biāo)儀檢測突變體細(xì)胞密度 (595) 和NR染色熒光強(qiáng)度 (Fluorescence intensity, FI)，從而篩選出高產(chǎn)油、高產(chǎn)DHA突變體；3) 對篩選出來的突變體進(jìn)行表型驗(yàn)證。最后，對表現(xiàn)較好的兩株高產(chǎn)油突變體進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，相較于野生型菌株，不僅生物量與油脂量增加顯著，而且DHA產(chǎn)量也分別超過45.51%和66.46%，初步展示出其工業(yè)應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)

菌株裂殖壺菌SR21 (ATCC- MYA-1381) 購自美國模式培養(yǎng)物保藏所 (The Type Culture Collection, ATCC)，保存在固體種子培養(yǎng)基上，并留種保藏于?80 ℃冰箱的甘油管中。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖5；酵母提取物1；蛋白胨1；海水晶30；瓊脂15。

篩選培養(yǎng)基修改于種子培養(yǎng)基，將海水晶濃度增至40 g/L。

初始搖瓶培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30；酵母提取物10；NaCl 0.3；Na2SO415；谷氨酸鈉15；K2SO41；MgSO4?7H2O 4；KH2PO40.1；CaCl20.05；vitamin B10.008；vitamin B60.002；vitamin B120.008。

初始發(fā)酵罐培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖50；酵母提取物10；NaCl 0.3；谷氨酸鈉15；K2SO41；MgSO4?7H2O 4；KH2PO40.1；CaCl20.05；vitamin B10.008；vitamin B60.002；vitamin B120.008。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)[8]：將培養(yǎng)至對數(shù)期的種子培養(yǎng)液，以4% (/) 的接種量接種于裝有100 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶 (500 mL) 中，于28 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。在培養(yǎng)第3天加入40 g/L的葡萄糖和10 g/L甘油，第4天加入20 g/L的甘油。每12 h收集1 mL培養(yǎng)液，測量595值，發(fā)酵結(jié)束后，收獲培養(yǎng)液用于細(xì)胞干重 (Dry cell weight, DCW)、油脂含量和DHA含量測定。每個菌株設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵：發(fā)酵策略修改于文獻(xiàn)[8]中單碳源 (僅葡萄糖) 補(bǔ)料策略，氮源的補(bǔ)料時間為24 h和36 h。發(fā)酵時的工作液為2 L，用16 mmol/L HNO3調(diào)節(jié)pH值使保持在6.5–8.0 之間，培養(yǎng)溫度為28 ℃。通氣策略：保持轉(zhuǎn)速為300 r/min，空氣流速為90 L/h。每12 h取發(fā)酵液80 mL用于DCW、總油脂量和脂肪酸組成的測定。

1.2 紫外線 (UVC) 誘變構(gòu)建裂殖壺菌突變體庫

以裂殖壺菌作為出發(fā)菌株，接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)液10 mL稀釋到一定細(xì)胞密度 (約105個/mL) 分裝于培養(yǎng)皿中，在2支15 W紫外燈 (輻照度約為0.5 mW/cm2) 下分別照射不同時間，照射結(jié)束后，放置黑暗條件12 h 左右，取出培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)液均勻涂布于平板上培養(yǎng)2 d后，分別計數(shù)菌落數(shù)，計算致死率。

致死率=(1–不同處理菌落數(shù)/未處理菌落數(shù)) ×100%。

通過致死率曲線，得出紫外線最佳誘變時間。以最佳誘變時間進(jìn)行多次紫外誘變，基本步驟同上，最后將單克隆挑取、轉(zhuǎn)接于新平板并編號、弱光保存，以此構(gòu)建裂殖壺菌突變體庫。

1.3 裂殖壺菌的NR染色條件優(yōu)化與突變體篩選

取裂殖壺菌培養(yǎng)至對數(shù)期的培養(yǎng)液適量， 3 000×離心15 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用新鮮的種子培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度約為107個/mL，分別取1 mL重懸液于棕色離心管中，分別加入250 μL的一定體積分?jǐn)?shù)的DMSO溶液，振蕩混勻，再加入適量的0.1 mg/mL NR染液，再次振蕩混勻，于恒溫水浴鍋中孵育一段時間后，取96孔黑色酶標(biāo)板，每孔加入200 μL NR菌細(xì)胞染液，使用多功能酶標(biāo)儀 (Filter Max F5, Molecular Devices, USA) 檢測激發(fā)光波長為 (485±20) nm、發(fā)射光波長為 (595±10) nm的熒光強(qiáng)度，并扣除未染色菌液的熒光強(qiáng)度，即為所測得的熒光強(qiáng)度。

裂殖壺菌的NR染色條件優(yōu)化：初始NR染色條件，溶劑載體DMSO溶液濃度為25%；NR染液的用量為15 μL；孵育的時間為15 min；孵育的溫度為50 ℃。然后對這4個條件逐一進(jìn)行優(yōu)化。所有染色組和未染色組均設(shè)置3個生物學(xué)平行。

裂殖壺菌突變體的篩選：分別挑取裂殖壺菌突變體接種于裝有200 μL篩選培養(yǎng)基的96孔透明板，培養(yǎng)一段時間，先利用多功能酶標(biāo)儀測量595值，然后用排槍將各孔培養(yǎng)液轉(zhuǎn)于96孔黑色酶標(biāo)板中，進(jìn)入優(yōu)化的NR染色步驟，利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行NR熒光測量。篩選出每板FI/595值前五的突變體，進(jìn)行重復(fù)篩選，并轉(zhuǎn)板保存。

1.4 裂殖壺菌油滴形態(tài)的熒光顯微鏡觀察

取適量裂殖壺菌培養(yǎng)液，3 000×離心5 min，加一定新鮮培養(yǎng)基重懸，加入適量DMSO，用NR染液染色一段時間后，吸取10 μL菌細(xì)胞染液制片，并加入2 μL熒光抗淬滅劑 (P0126, Beyotime, China)，置于激光掃描共聚焦顯微鏡 (Leica TCS SP8, USA) 下進(jìn)行觀察。使用488 nm的氬激光器激發(fā)，在560–600 nm過濾通道檢測標(biāo)記油滴形態(tài)的NR熒光[28]，熒光圖片由Leica自帶軟件 (LAS AF Lite) 處理。

1.5 細(xì)胞干重、總油脂量和脂肪酸組成的測量

細(xì)胞干重的測量：收集發(fā)酵液適量，3 000×離心15 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌，再次離心去上清，置于?80 ℃冰箱冷凍后，用真空冷凍干燥機(jī) (FreeZone 6 Plus, Labconco, USA) 進(jìn)行干燥后稱重，測得DCW。

總油脂提取與測量 (采用Blight-Dyer法[34]，略有修改)：稱取少量菌體干粉，加入1.5 mL氯仿/甲醇 (1∶2,/) 渦旋1 min，離心 (2 057×, 15 min) 后收集上清液于15 mL離心管中，下層殘留液繼續(xù)用1 mL氯仿/甲醇 (1∶2,/) 萃取3次后，合并所有有機(jī)相于預(yù)先稱重的玻璃管中，置于氮吹儀下吹干，再稱重，獲得總油脂量。

脂肪酸甲酯化 (參考文獻(xiàn)[35]中方法，略有優(yōu)化)：向提取的油脂中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL，60 ℃水浴加熱至油脂完全溶解，再加入1 mL的14% BF3-甲醇溶液，60 ℃水浴酯化20 min，流水冷卻至室溫后，多次加入2 mL色譜級正己烷 (Sigma公司，美國) 萃取至有機(jī)相為無色透明，加入0.5 g 無水Na2SO4吸收殘余水，離心后，用注射器吸取，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后注入棕色瓶，用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (Gas chromatograph- mass spectroscopy, GC-MS) 分析。

GC-MS分析：采用Agilent HP 7890A (Avondale, PA, USA) 氣相色譜與MSD-5957C質(zhì)譜檢測聯(lián)用裝置進(jìn)行檢測分析，使用Agilent HP-88 (60 m× 0.25 mm×0.25 μm) 色譜柱，噴射器溫度保持250 ℃，分流比1∶20，氦氣流速為1.0 mL/min，柱溫165 ℃維持10 min，5 ℃/min速率升至210 ℃并保持5 min，進(jìn)樣口接口溫度250 ℃，探測器電壓1.50 kV，采用自動進(jìn)樣裝置 (GC Sampler 80, Agilent Technologies) 進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 μL。采用全掃描模式 (/, 20–500)，使用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線 (UVC) 誘變構(gòu)建裂殖壺菌突變體庫

為了安全、快速構(gòu)建裂殖壺菌突變體庫，本研究選用UVC (253 nm) 作為裂殖壺菌隨機(jī)突變的誘變劑。如圖1所示，在UVC的輻照度約為0.5 mW/cm2下，隨著UVC照射時間增加 (0–20 s)，細(xì)胞的致死率急劇上升，直到照射時間為40 s時，致死率達(dá)到92.40%，隨后 (40–80 s) 呈緩慢上升趨勢，在照射時間為100 s時，只有少數(shù)幾個克隆存活，致死率幾乎達(dá)到100%。根據(jù)育種工作者長期的研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，一般認(rèn)為致死率以90%–99%效果較好，且較低的致死率有利于正突變的產(chǎn)生[36]，故選擇UVC照射40 s作為誘變劑量。確定好誘變劑 (UVC) 和誘變劑量 (照射40 s)后，對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，構(gòu)建了一個約含3 600個克隆的隨機(jī)突變體庫。

圖1 紫外線(UVC)照射時間對裂殖壺菌的致死效應(yīng)

2.2 裂殖壺菌NR染色條件的優(yōu)化

為了更準(zhǔn)確地通過NR染色熒光強(qiáng)度表征裂殖壺菌的中性油脂含量，則需要優(yōu)化裂殖壺菌 NR染色的如下條件：1) 溶劑載體二甲基亞砜 (DMSO) 濃度；2) NR的終濃度；3) 孵育時間；4) 孵育溫度。

2.2.1 溶劑載體DMSO濃度的優(yōu)化

由于細(xì)胞壁的存在以及NR是脂溶性的染料，這會很大程度影響NR擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而影響NR染色效果，最終使得中性油脂含量的測量結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性[37]。NR染色時，加入適量的NR溶劑載體如DMSO[32]，能有效增加細(xì)胞壁的滲透性和NR的擴(kuò)散能力，增強(qiáng)NR染色熒光強(qiáng)度。本研究選用DMSO作為NR染色的溶劑載體，并摸索適用于裂殖壺菌的最佳DMSO溶液濃度。如圖2A，在DMSO溶液濃度 (/) 為0–20%時，NR染色的熒光強(qiáng)度逐漸增加；直到DMSO溶液濃度為20%時，NR染色的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；在DMSO溶液濃度為20%–50%時，NR染色的熒光強(qiáng)度反而逐漸降低。因此，隨后的其他NR染色條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，均以DMSO溶液濃度為20%來進(jìn)行。

2.2.2 NR終濃度的優(yōu)化

在一定的細(xì)胞密度情況下，過低的NR終濃度會使熒光強(qiáng)度偏低，無法切實(shí)反映出細(xì)胞中性油脂高低。而過高的NR終濃度也會使熒光強(qiáng)度偏低，是因?yàn)檫^多的NR分子會發(fā)生堆積現(xiàn)象，從而使與中性油脂結(jié)合的NR分子更多地暴露在樣品中的親水性淬滅劑中，所測的熒光強(qiáng)度就自然偏低[38]。如圖2B所示，當(dāng)NR終濃度為2.0 μg/mL時，染色熒光強(qiáng)度最大，而過低 (<1.0 μg/mL) 或過高 (>3.0 μg/mL) 的NR濃度都會出現(xiàn)熒光強(qiáng)度明顯下降的現(xiàn)象。所以選擇2.0 μg/mL作為最佳的NR終濃度。

2.2.3 孵育時間的優(yōu)化

NR分子需要一定時間的擴(kuò)散才能透過細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，與胞內(nèi)中性油脂充分接觸產(chǎn)生熒光，但過長的孵育時間，會導(dǎo)致NR分子的堆積而使其溶解度降低，加之待測樣中水溶性淬滅劑的存在，最終會加快熒光的淬滅[38-39]，因此適當(dāng)?shù)姆跤龝r間對中性油脂的準(zhǔn)確測量很是重要。如圖2C所示，分析了不同NR孵育時間對熒光強(qiáng)度的影響，隨著NR孵育時間增加，NR染色熒光強(qiáng)度也逐漸增加，直到孵育時間為10 min時達(dá)到最大值，隨后NR染色熒光強(qiáng)度逐漸下降。由此，選擇10 min 作為最佳孵育時間。

2.2.4 孵育溫度的優(yōu)化

較高的NR孵育溫度會加快NR分子擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)NR染色熒光，但過高的孵育溫度會加速NR染色熒光的淬滅，所以尋求合適的孵育溫度很有必要。如圖2D所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NR孵育溫度為10–40 ℃時，NR染色熒光逐漸增強(qiáng)，并在40 ℃達(dá)到最大值；而當(dāng)NR孵育溫度從40 ℃到70 ℃時，熒光逐漸減弱。類似的結(jié)論，也出現(xiàn)在Chen等[32]優(yōu)化小球藻NR孵育溫度的研究中。因此，得到最佳NR孵育溫度為40 ℃。

2.3 選用熒光強(qiáng)度 (Fluorescence intensity, FI) 與OD595的比值 (FI/OD595) 作為篩選高產(chǎn)油突變體的依據(jù)

在實(shí)際篩選裂殖壺菌高產(chǎn)油突變體過程中，由于各個突變體的接種量和培養(yǎng)過程中的生長狀態(tài)均存在差異，使得NR染色時各突變體的細(xì)胞密度不一，會直接影響到油脂量高低的判斷。因此需要測量細(xì)胞密度，得到單位細(xì)胞密度的熒光強(qiáng)度，以解決由細(xì)胞密度不同帶來的影響。為了快速、高通量地獲得細(xì)胞密度，本研究巧妙地采用了多功能酶標(biāo)儀測光密度 (Optical density,) 的方法。

理論上，在某一時刻、某一培養(yǎng)條件下，裂殖壺菌的單位細(xì)胞密度油脂量應(yīng)該是一個常數(shù)，即FI/595是一個常數(shù)。如圖3所示，對同一培養(yǎng)條件下的裂殖壺菌細(xì)胞的不同595值與其對應(yīng)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析 (取截距為0)，發(fā)現(xiàn)兩者存在極顯著的相關(guān)性 (相關(guān)系數(shù)為0.999 7)，熒光強(qiáng)度 () 與595值 () 的比值是一個常數(shù) (26.423×107)。因此，可以用熒光強(qiáng)度與595的比值 (FI/595) 來表示裂殖壺菌單位細(xì)胞密度中性油脂量，并作為高產(chǎn)油突變體的篩選依據(jù)。

2.4 裂殖壺菌NR染色時間點(diǎn)的選擇

在實(shí)際篩選過程中，為了在保證能最大程度地區(qū)分高產(chǎn)油突變體的前提下進(jìn)一步縮短篩選時間，則需要縮短裂殖壺菌發(fā)酵過程的3個時期[7]，即細(xì)胞快速生長期、油脂大量積累期和穩(wěn)定期。為此，選用了能維持裂殖壺菌經(jīng)歷發(fā)酵過程3個時期的篩選培養(yǎng)基[8]。如圖4所示，采用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌，經(jīng)過較短 (0–18 h) 的細(xì)胞快速生長期直接進(jìn)入了穩(wěn)定期，其中，在0–6 h時，細(xì)胞密度 (595) 快速上升，雖細(xì)胞油脂 (FI) 有少量積累，但單位細(xì)胞密度油脂量 (FI/595) 反而下降；隨后的6–18 h過程中，細(xì)胞密度快速上升的同時細(xì)胞油脂積累也是急劇增加。進(jìn)入18–30 h的穩(wěn)定期，細(xì)胞密度幾乎保持平穩(wěn)，細(xì)胞油脂 (FI) 積累稍微增加，單位細(xì)胞密度油脂量在30 h時達(dá)到最大值。最后，進(jìn)入衰弱期 (發(fā)酵時一般在此時期前就停止發(fā)酵，因此發(fā)酵時無此時期)，細(xì)胞死亡量增加、細(xì)胞破碎以及自身油脂反耗，細(xì)胞密度和細(xì)胞油脂積累均下降。為了盡可能地提高篩選的準(zhǔn)確性，則需要突變體的單位細(xì)胞密度油脂量大于WT的最大單位細(xì)胞密度油脂量。綜上所述，選擇培養(yǎng)30 h時作為NR染色的時間點(diǎn)。

圖3 OD595值與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性

圖4 裂殖壺菌在篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)下的細(xì)胞生長與油脂積累的時間過程

2.5 裂殖壺菌隨機(jī)突變體庫的篩選結(jié)果

利用多功能酶標(biāo)儀以及摸索好的篩選條件，對裂殖壺菌隨機(jī)突變體庫進(jìn)行了高通量的篩選。為了更進(jìn)一步提高篩選的準(zhǔn)確性，初篩出每兩個96孔板FI/595值前5的突變體，然后重復(fù)第一輪篩選流程進(jìn)行復(fù)篩。如圖5所示，展現(xiàn)的是復(fù)篩的結(jié)果，以野生型 (Wild type, WT) 裂殖壺菌的FI/595值作為分界線，將復(fù)篩的突變體分為兩組：一組是FI/595值高于WT的油脂量上升組 (Up group)，包含55個突變體；另一組是FI/595值低于WT的油脂量下降組 (Down group)，包含40個突變體。在油脂量上升組中，突變體的FI/595值超出WT在0–50%之間的有74.55% (41/55)，超出WT 50%以上的有25.45% (14/55)，其中FI/595值前3的突變體 (★表示)，更是分別超出了85.37%、93.28%和116.33%。在油脂量下降組中，多數(shù)突變體的FI/595值集中在低于WT的30%以內(nèi)，最低FI/595值的突變體僅為WT的40.42%。

圖5 裂殖壺菌隨機(jī)突變體庫的復(fù)篩結(jié)果

2.6 高產(chǎn)油突變體的表型驗(yàn)證

為了證實(shí)所篩選出的突變體為高產(chǎn)油的突變體以及篩選方案的準(zhǔn)確性，選取FI/595值前3位的突變體 (D03432、D05106和D01521) 作進(jìn)一步的表型鑒定。首先，對這3株突變體進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，從生長狀態(tài) (生物量)、油脂積累 (油滴) 以及DHA含量等表型來進(jìn)行鑒定分析。如圖6所示，記錄的是3株突變體與WT搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵過程，觀察到3株突變體均要比WT生長得快，其中D03432和D05106的細(xì)胞生長速率較WT有顯著的提高 (<0.01,檢驗(yàn))。發(fā)酵至穩(wěn)定期132 h時，這兩株突變體的595值分別比WT高31.85%和27.45%。另外，突變體D01521也比WT高16.46%。

圖6 裂殖壺菌野生型與候選的高產(chǎn)油突變體在搖瓶發(fā)酵下的生長曲線

裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)的油脂積累變化規(guī)律是前期緩慢上升，對數(shù)期時快速上升，到穩(wěn)定期時經(jīng)緩慢上升后達(dá)到最高峰[7]，而合成的油脂則主要儲存于油滴 (Lipid droplets or oil bodies) 這一細(xì)胞器中[40-41]，因而為了更明顯區(qū)分突變體與WT油脂積累的差異，選擇在細(xì)胞積累油脂最快的時期 (36 h) 進(jìn)行油滴觀察。如圖7所示，NR染色后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)這3株的突變體細(xì)胞內(nèi)油滴直徑均要大于WT，而且突變體的細(xì)胞內(nèi)油滴數(shù)目較WT更多。

圖7 裂殖壺菌野生型與候選的高產(chǎn)油突變體在發(fā)酵36 h時的油滴形成情況

發(fā)酵結(jié)束后，測得突變體D01521、D03432 和D05106的干重依次為 (23.35±0.55) g/L、(30.10±0.35) g/L和 (28.49±1.35) g/L，均高于WT的干重 (20.22±1.18) g/L，其中突變體D03432更是比WT高出了有48.88%。同時，這3株突變體的油脂含量均顯著高于WT的43.19% (<0.05，檢驗(yàn))，突變體D03432和D05106的油脂量更是分別達(dá)到了干重的64.74%和63.13% (圖8A)。由此，證實(shí)這3株突變體均為高產(chǎn)油突變體，進(jìn)一步確認(rèn)了篩選方案的可行性和準(zhǔn)確性。除此之外，對這3株高產(chǎn)油突變體中DHA含量作了進(jìn)一步的分析，如圖8B所示，發(fā)現(xiàn)這3株突變體DHA含量 (占干重) 也明顯高于WT，WT的DHA含量 (占干重) 僅20.11%，而突變體D03432和突變體D05106的DHA含量 (占干重) 分別達(dá)到了32.00%和32.11%。然而，除了突變體D01521的DHA占總油脂的含量與WT有差異外，突變體D03432與D05106的DHA占總油脂的含量與WT并沒有顯著的差異 (>0.05，檢驗(yàn))，這說明篩選得到的高產(chǎn)油突變體積累的油脂仍保持著高品質(zhì)。由于篩選出來的高產(chǎn)油突變體的生物量明顯高于WT，在DHA最終產(chǎn)量上，3株高產(chǎn)油突變體都明顯高于WT (<0.05,檢驗(yàn))，突變體D05106達(dá)到了WT的2.26倍，而突變體D03432更是達(dá)到了WT的2.37倍。這說明篩選的這3株突變體不僅油脂含量高于WT，DHA產(chǎn)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WT。

最后，選取油脂量、DHA產(chǎn)量增加比較明顯的突變體D03432與D05106進(jìn)行5 L發(fā)酵驗(yàn)證，如圖9所示，這兩株突變體的最終干重分別達(dá)到了(36.25±2.58) g/L和(40.59±2.91) g/L，分別比WT的 (29.43±0.91) g/L提高23.17%和37.92%；在油脂含量方面，均達(dá)到干重的65%多，且均高于WT的52.44%；在最終DHA的產(chǎn)量上，突變體D03432達(dá)到 (11.54±0.47) g/L，是WT (7.88±0.84) g/L的1.47倍，D05106更是WT的1.66倍。根據(jù)油脂代謝途徑的理論計算得出DHA的理論得率為33.15%，而這兩個突變體的DHA實(shí)際得率分別為(8.31±0.41)%和 (7.72±0.24)%，比WT的 (5.27±0.47)%分別提高了57.69%和46.49%。綜上可知，篩選得到的突變體不僅在生物量和油脂含量均高于WT，而且DHA的產(chǎn)量和得率也都增加了50%左右，這將在工業(yè)應(yīng)用上凸顯出優(yōu)勢，同時再一次證明了本篩選方案的可靠性。

3 討論

如何提高裂殖壺菌的油脂量、DHA產(chǎn)量，一直是利用裂殖壺菌這類微生物生產(chǎn)富含DHA油脂的重要研究內(nèi)容。本研究從獲取高產(chǎn)油、高產(chǎn)DHA裂殖壺菌突變體為目的出發(fā)，設(shè)計出一套易操作的基于尼羅紅染色的高通量篩選方案。此方案大大縮短了高產(chǎn)油菌株育種時間，從突變體建庫到高產(chǎn)油菌株的獲得與驗(yàn)證，僅僅只需要3周。利用本篩選方案，成功地篩選出3株高產(chǎn)DHA油脂的突變體，并對其中兩株表現(xiàn)較好的突變體 (D03432和D05106) 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至5 L發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)這兩株突變體在生物量、油脂含量和DHA產(chǎn)量上均優(yōu)于野生型，可能具有更好的工業(yè)應(yīng)用潛力。與此同時，本方案不僅能高通量篩選出高產(chǎn)油突變體，也能篩選出低產(chǎn)油突變體，而這些低產(chǎn)油突變體恰好是研究裂殖壺菌油脂代謝通路的重要資源，這有助于我們對脂肪酸的合成機(jī)制有更深入的了解，從而更好地開展相關(guān)研究工作。

本研究中篩選得到的這3株突變體已證實(shí)油脂量均有所增加，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相較于WT，它們在搖瓶發(fā)酵時的各脂肪酸組成的變化趨勢并不一致 (表1)。這說明這3株突變體可能突變的基因或通路存在差異。目前發(fā)現(xiàn)，裂殖壺菌可能同時存在兩種脂肪酸合成通路：負(fù)責(zé)肉豆蔻酸 (C14:0)、軟脂酸 (C16:0) 和硬脂酸 (C18:0) 等飽和脂肪酸合成的Ⅰ型脂肪酸合酶通路 (Type Ⅰ fatty acid synthase pathway, FAS) 和負(fù)責(zé)如EPA (C20:5)、DPA (C22:5) 和DHA (C22:6) 等多不飽和脂肪酸合成的多聚酮合酶通路 (Polyketide synthase pathway, PKS)，并且這兩條通路都是由乙酰輔酶A (Acetyl-CoA) 作為前體物質(zhì)和由NADPH提供還原力的[42-46]。突變體D01521的脂肪酸組成結(jié)果顯示，飽和脂肪酸如C14:0、C16:0和C18:0均不同程度上升，其中C16:0占油脂含量 (34.24%) 較WT (25.51%) 上升明顯，而不飽和脂肪酸DPA和DHA含量則相對下降了。那么在突變體D01521中，突變的基因可能發(fā)生在FAS通路后端，導(dǎo)致C16:0等飽和脂肪酸合成增加，而PKS通路中基因并未發(fā)生突變，從而使得DPA與DHA占總油脂的含量相對下降。而突變體D03432和D05106的脂肪酸組成結(jié)果顯示，相較于WT，C16:0等飽和脂肪酸含量均有所增加，但DHA等不飽和脂肪酸含量并未出現(xiàn)明顯差異。這說明D03432和D05106中突變的基因可能發(fā)生在乙酰輔酶A的合成通路前端或者乙酰輔酶A其他消耗通路中，導(dǎo)致乙酰輔酶A更多地流入脂肪酸合成通路中，從而使得各脂肪酸的含量都相對增加了。裂殖壺菌脂肪酸合成通路的具體機(jī)制并沒有完全解析清楚，因此這3株高產(chǎn)油突變體的具體突變基因或通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

值得一提的是，本篩選方案中如尼羅紅染色條件、篩選指標(biāo)選擇以及尼羅紅染色時間點(diǎn)的選擇等步驟可以針對不同產(chǎn)油微生物進(jìn)行個性化的優(yōu)化，從而大大擴(kuò)寬本篩選方案的適用范圍與參考價值。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，將紫外誘變的單克隆從恢復(fù)平板上挑取后，無需進(jìn)行中間的突變體建庫，直接接種96孔板培養(yǎng)后進(jìn)入尼羅紅染色篩選流程 (經(jīng)過尼羅紅染色后，突變體仍能存活)，然后僅將高或低FI/595值的突變體進(jìn)行保存，這樣可以省去中間建庫步驟，進(jìn)一步節(jié)省時間成本，提高篩選效率。

表1 高產(chǎn)油突變體在搖瓶發(fā)酵時的脂肪酸組成

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Screening for hyper-accumulating lipid mutants inAurantiochytrium limacinum using high-throughput fluorescence-based method

Guangqian Duan1,2, Shuoshuo Li3, Xin Li3, and Kaiyao Huang1

1 Key Laboratory of Algal Biology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, Hubei, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, Hubei, China

Docosahexaenoic acid (DHA) has many unique physiological functions such as promoting the development of brain and retina in infants. Therefore, it is widely applied to food, pharmacy, breeding and other industries. To obtain engineered strainsofSR21 suitable for industrial application with increased lipid and DHA production, we designed a simple, fast, accurate and high-throughput screening method based on Nile red staining of oil droplets. First, ultraviolet C (UVC) mutagenesis was used to generate a random mutant library of. Second, screening conditions were optimized including staining conditions of Nile red and the sorting criterion. Thereby, three putative high-lipid mutants (D03432, D05106 and D01521) were selected from the mutant library containing 3 648 mutated clones. The three mutants grew faster and produced higher amounts of lipids and DHA compared to wild type (WT). In 100 mL cultures, the lipid content of D03432 and D05106 mutants reached 64.74% and 63.13% of dry cell weight respectively, whereas the wild strain exhibited only 43.19%. DHA yield in these two mutants were even 2.26-fold and 2.37-fold higher than that of the wild strain. Experiment with 5 L fermentor further confirmed that D03432 and D05106 mutants had better performance than the wild strain on DHA yield (45.51% and 66.46% more than that of the wild strain, respectively), and demonstrated their high potential for industrial application. This work not only generated several high-DHA content mutants with high potential for industrial use, but also provided vital guidance for high-throughput screening of lipid hyper-accumulating mutants in other oil-producing microorganisms.

oil droplets, high-throughput screening, docosahexaenoic acid (DHA), Nile red staining

March 4, 2019;

May 8, 2019

Key Project of Technological Innovation in Hubei Province (No. 2016ABA120).

Kaiyao Huang. Tel: +86-27-68780901; E-mail: huangky@ihb.ac.cn

湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng) (重大項(xiàng)目) (No. 2016ABA120) 資助。

段光前, 李碩碩, 李鑫, 等. 裂殖壺菌高產(chǎn)油突變體的高通量篩選. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(7): 1335–1347.

Duan GQ, Li SS, Li X, et al. Screening for hyper-accumulating lipid mutants inusing high-throughput fluorescence-based method. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1335–1347.

(本文責(zé)編 郝麗芳)