李文 莫港澳 孫欣

摘要：以不動桿菌（Acinetobacter indicus）JL-1為菌種，使用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基測定其解磷性能。采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定最佳解磷條件：碳源為10.0 g/L蔗糖，2.0 g/L復(fù)合氮源（硫酸銨與酵母粉質(zhì)量濃度比為1 ∶ 1），pH值為7.5，溫度為37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL。在此最優(yōu)條件下，解磷量在48 h時(shí)最高，為61.02 μg/mL，菌落數(shù)為2.69×1011 CFU/mL，發(fā)酵過程中pH值呈先下降后略上升的趨勢。通過對其解磷機(jī)制進(jìn)行初步研究，確定此菌株以酸解為主、酶解為輔的方式來解磷。

關(guān)鍵詞：解磷菌;不動桿菌;正交試驗(yàn);解磷性能;解磷機(jī)制

中圖分類號： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0311-05

磷元素是植物成長進(jìn)程中的一種重要元素[1]，廣泛地參加植物細(xì)胞內(nèi)多種生理生化進(jìn)程，能夠顯著有效地促進(jìn)植物生長發(fā)育和新陳代謝過程[2]。我國大約有74%的耕地缺磷，并且土壤中的絕大部分磷是無效磷，植物難以吸收使用[3-4]，而施用磷肥又會對環(huán)境和經(jīng)濟(jì)造成不良的影響[5]。土壤中存在大量的解磷菌，包括細(xì)菌、放線菌和酵母菌，它們能將難溶性的磷轉(zhuǎn)化為農(nóng)作物可吸收利用的可溶性磷，促進(jìn)農(nóng)作物生長，改善土壤環(huán)境，顯著提高土壤中的有效磷含量，因此，解磷菌的研究與應(yīng)用對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義，有助于緩解我國土壤磷素缺乏和環(huán)境污染問題。

影響解磷微生物解磷性能一方面是由于解磷微生物自身的遺傳特性差異，除此之外，諸多物理化學(xué)因素也對解磷微生物分解磷化合物產(chǎn)生重要影響，例如土壤中磷素的種類和含量、酸堿度、溫度、土壤成分等因素。解磷微生物獲得的碳、氮營養(yǎng)通過影響微生物的生長和代謝過程，也可以影響微生物對土壤中磷化合物的分解。許多學(xué)者通過對解磷菌株在多種碳氮源下的解磷能力進(jìn)行測定，考察能量來源對微生物解磷效應(yīng)影響的大小，并尋找最優(yōu)碳氮源。趙小蓉等研究了解磷微生物培養(yǎng)基中碳源、氮源以及碳氮比對于解磷微生物解磷的影響，認(rèn)為解磷微生物生長代謝受碳源、氮源以及碳氮比影響，其中突出表現(xiàn)為解磷菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸受此影響很大[6]。

解磷菌的解磷過程是個復(fù)雜的過程，解磷機(jī)制比較復(fù)雜，解磷能力也表現(xiàn)出差異。有些微生物在土壤缺磷的情況下，向外分泌植酸酶、核酸酶、磷酸酶等，將無效磷轉(zhuǎn)化為有效形式[7-8]。還有些微生物解磷與其產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)，這些有機(jī)酸能夠降低pH值，與鐵、鋁、鈣、鎂等離子結(jié)合，從而使難溶性的磷酸鹽溶解[9-11]。而有些菌株這2種機(jī)制都存在，在其解磷過程中共同作用，從而導(dǎo)致難溶磷的溶解[12]。每種解磷微生物解磷的方式各不相同，具有明顯的特異性。

本研究對前期篩選所得的不動桿菌JL-1進(jìn)行解磷性能初步測定，通過對培養(yǎng)基及條件進(jìn)行優(yōu)化以提高解磷菌的解磷性能，繼而初步探究其解磷機(jī)制，以期為利用此解磷菌用于微生物肥料生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論支撐，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

土壤中篩選出的不動桿菌（Acinetobacter indicus）JL-1，保藏于徐州工程學(xué)院微生物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

723C可見分光光度計(jì)HYG（上海欣茂儀器有限公司）、旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司）、DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 無機(jī)磷液體培養(yǎng)基 10.00 g葡萄糖、25.00 g Ca3（PO4）2、0.50 g（NH4）2SO4、0.20 g NaCl、0.20 g KCl、0.10 g MgSO4·7H2O、0.03 g FeSO4·7H2O、0.03 g MnSO4·4H2O、0.50 g酵母粉，1 000 mL水，pH值為6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 LB液體培養(yǎng)基 5.00 g蛋白胨、5.00 g NaCl、2.50 g牛肉浸膏、500 mL蒸餾水、pH值在7.0左右，121 ℃滅菌20 min。

1.3.3 LB固體培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，使其濃度為18 g/L。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 斜面活化 將實(shí)驗(yàn)室保存的不動桿菌JL-1轉(zhuǎn)接至已滅菌的LB斜面，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子液制備 用接種環(huán)刮取斜面菌株接入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng) 24 h 得種子液。

1.4.3 液體發(fā)酵檢測菌株解磷能力 以1%（體積比）接種量將種子液接入無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，裝液量為 100 mL/250 mL，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，檢測上清液中的磷含量，以不接菌的處理作為對照。采用磷鉬藍(lán)比色法測定磷含量[13]。

1.4.4 菌株JL-1最適解磷條件研究

1.4.4.1 單因素試驗(yàn) 選取不同濃度碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、羧甲基纖維素鈉）、不同濃度氮源（硫酸銨、草酸銨、硝酸鉀、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）、初始pH值（5.5、6.5、7.0、7.5、8.5）、溫度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃）、裝液量（30、50、80、100、120 mL），測定其對菌株JL-1解磷能力的影響。

1.4.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取碳源濃度、氮源濃度、初始pH值、溫度等4個較為顯著的影響因素，采用L16（34）正交表進(jìn)一步研究這4個因素對菌株JL-1解磷能力的影響，因素水平見表1。

1.4.5 菌株JL-1解磷曲線 將菌株JL-1在最佳發(fā)酵條件下連續(xù)培養(yǎng)72 h，從0 h起，每12 h取樣1次，測定菌落數(shù)、pH值及解磷量。采用稀釋涂布法測定菌落數(shù)，將發(fā)酵液用無菌水準(zhǔn)確稀釋至10-8、10-9、10-10，用涂布棒緩慢均勻地涂布在準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行，48 h后計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，取3組平行的平均值。

1.4.6 菌株JL-1解磷機(jī)制 將菌株于最佳條件下培養(yǎng) 48 h 后，使用細(xì)菌過濾器將發(fā)酵液過濾除菌，作以下4種處理：（1）置于121 ℃滅菌5 min使酶類失活，以測定過濾液中各種有機(jī)酸類對磷酸鈣的溶解效果;（2）在無菌條件下調(diào)節(jié)pH值至7.0，以消除濾液中各類有機(jī)酸的影響，測定濾液中酶類對磷酸鈣的溶解作用;（3）既不調(diào)節(jié)pH值，也不做滅活處理，以測定濾液中酶類和有機(jī)酸對磷酸鈣的共同作用;（4）設(shè)置對照（CK），即滅活并調(diào)節(jié)pH值。上述4種處理各 50 mL，與50 mL新鮮的無機(jī)磷培養(yǎng)基混合后，置于37 ℃、150 r/min 的恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)48 h，測定上清液中的磷含量。同時(shí)，將 100 mL 無機(jī)磷培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，用鹽酸分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，置于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)48 h后，測定上清液中的磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌株JL-1解磷能力的影響

2.1.1 不同碳源對菌株解磷能力的影響 碳源是微生物生長過程中所必需的一種養(yǎng)分，微生物對不同碳源的利用能力不同導(dǎo)致其生長及代謝速度不同，從而影響菌株的解磷能力。由圖1可知，菌株JL-1在以蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖為碳源時(shí)，具有較強(qiáng)的解磷能力，且以蔗糖為碳源時(shí)解磷能力最好。這表明菌株JL-1能夠較好地利用蔗糖，且蔗糖的成本低于葡萄糖，有利于大規(guī)模發(fā)酵。因此，確定最佳碳源為蔗糖。

2.1.2 碳源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響 由圖2可知，解磷量隨蔗糖濃度的增大呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)蔗糖濃度為15 g/L時(shí)解磷效果最好。

2.2 氮源對菌株JL-1解磷能力的影響

2.2.1 不同氮源對菌株解磷能力的影響 氮是構(gòu)成微生物重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸等的主要元素，是微生物生長的主要營養(yǎng)物[14]。由于微生物對不同氮源的吸收轉(zhuǎn)化及利用能力不同，選擇最佳的氮源能有效地提高解磷菌的解磷能力。由圖3可知，使用單一氮源時(shí)，有機(jī)氮源酵母粉最佳，解磷量為51.35 μg/mL，無機(jī)氮源硫酸銨最佳，解磷量為 29.40 μg/mL，這與楊慧等的研究結(jié)果[15]一致。采用硫酸銨與酵母粉等質(zhì)量濃度復(fù)合，與單獨(dú)使用這2種氮源進(jìn)行比較，由圖4可知，2種氮源復(fù)合時(shí)解磷量最高為54.15 μg/mL，優(yōu)于單一氮源的解磷量。因此，菌株JL-1的最優(yōu)氮源為酵母粉和硫酸銨組成的復(fù)合氮源。

2.2.2 氮源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響 影響微生物代謝的一個重要因素是碳氮比，因此不同的氮源濃度對菌株解磷能力有很大影響。由圖5可知，氮源濃度在0.5～1.5 g/L 范圍內(nèi)，解磷量逐漸增加;氮源濃度在1.5～2.5 g/L范圍內(nèi)，解磷量逐漸下降，因此，解磷菌JL-1的最適氮源濃度為1.5 g/L。

2.3 初始pH值對菌株解磷能力的影響

pH值除了直接影響微生物細(xì)胞以外，還對細(xì)胞產(chǎn)生一些間接影響，例如pH值能夠使生物細(xì)胞膜上所帶的大量電荷發(fā)生改變，嚴(yán)重影響細(xì)胞吸收的營養(yǎng)物的離子化程度，致使微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力發(fā)生極大改變[16]。因此，確定合適的初始pH值，有利于提高解磷的能力和效率。由圖6可知，初始pH值在5.5～7.0之間解磷量逐漸增加;初始pH值在 7.0～8.5之間解磷量逐漸下降，因此解磷最適pH值為7.0，偏酸或偏堿均不利于菌株進(jìn)行解磷。

2.4 溫度對菌株JL-1解磷能力的影響

溫度為影響微生物生長和代謝環(huán)境條件中的重要因素之一，當(dāng)溫度在微生物能夠適應(yīng)的最適范圍內(nèi)緩慢變化時(shí)，它的生長和代謝也會同時(shí)發(fā)生相應(yīng)的變化。若外界環(huán)境超過這個溫度范圍，就會導(dǎo)致該生物生長發(fā)育困難和代謝水平急劇下降。由圖7可知，在25～30 ℃之間，隨著溫度升高解磷量逐漸升高，在30～40 ℃之間解磷量逐漸降低，由此可以確定菌株最適解磷溫度為30 ℃。此時(shí)菌株生長代謝旺盛，有利于對磷酸鈣的降解。

2.5 裝液量對菌株JL-1解磷能力的影響

絕大多數(shù)微生物生長發(fā)育及其代謝過程中須要消耗氧氣，因此培養(yǎng)液中的溶解氧也會對菌體的生長代謝有一定的影響，進(jìn)而影響菌體的解磷能力。裝液量在30～120 mL范圍內(nèi)變化時(shí)，解磷量呈先升后降的趨勢，當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，解磷效果最好，當(dāng)溶解氧減少時(shí)菌株解磷效果漸差，表明解磷菌好氧。在裝液量為30 mL時(shí)，雖然菌體與空氣接觸的機(jī)會大，但可能是由于裝液量太少，在搖床中培養(yǎng)時(shí)，菌體與搖瓶之間的劇烈撞擊對菌體造成些許不良影響，影響到菌體的解磷，導(dǎo)致解磷量較50 mL時(shí)有所下降[17]。

2.6 正交試驗(yàn)確定解磷最佳條件

選取解磷過程中的主要影響因素（碳源濃度、氮源濃度、溫度、初始pH值）進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由k值可以看出最優(yōu)組合為A1B3C3D3，該組合在正交試驗(yàn)的9組試驗(yàn)中的解磷量也最高，由此確定菌株JL-1的最適解磷條件：碳源濃度為10.0 g/L，復(fù)合氮源（硫酸銨與酵母粉質(zhì)量濃度比為 1 ∶ 1）濃度為2.0 g/L，初始pH值為7.5，溫度為37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL。從R值看出4個因素對解磷量的影響表現(xiàn)為氮源濃度>碳源濃度>溫度>pH值，這與方差分析結(jié)果是一致的，由表3可以看出，氮源濃度對菌株JL-1解磷能力的影響是顯著的（P<0.05），這表明相對于其他3個因素，氮源濃度是影響菌株解磷能力的最主要因素。