何建清 張格杰 趙偉進

摘要：以珍稀植物砂生槐為材料，對該植物根瘤內(nèi)生細菌種群組成及其促生潛力進行研究，為砂生槐在荒漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與重建中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。采用YMA培養(yǎng)基通過平板涂布分離法分離內(nèi)生細菌，通過16S rDNA序列同源性分析其遺傳多樣性，采用溶磷圈和鉬銻抗比色法測定溶磷能力，Salkowski比色法測定IAA分泌量，微量凱氏定氮法測定固氮量。結(jié)果表明，從砂生槐根瘤中分離到19株代表性內(nèi)生細菌，分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）和普羅威登斯菌屬（Providencia）等5個屬，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。在19株供試細菌中，7株具有良好的溶解無機磷能力，溶磷量達到 100 mg/L 以上;6株菌株具有良好的溶解有機磷能力，溶磷量達到42 mg/L以上;5株菌株具有良好的固氮能力，固定氮量達 44 mg/L 以上;3株菌株具有良好的IAA分泌能力，IAA分泌量達45 μg/mL以上。利用種子發(fā)芽指標測定高溶磷菌株的促生能力，其中菌株R24能明顯提高砂生槐種子的萌發(fā)率。綜上，西藏砂生槐根瘤內(nèi)生細菌遺傳多樣性豐富，且具有良好促生能力，是重要的生物資源。

關(guān)鍵詞：砂生槐;根瘤;內(nèi)生細菌;16S rDNA;促生能力

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0297-05

在研究根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的過程中，人們發(fā)現(xiàn)根瘤中同時定居著許多與根瘤菌不同的內(nèi)生菌，這些非共生細菌生活在根瘤中，但不引起植物產(chǎn)生明顯的病害，為根瘤內(nèi)生細菌[1-2]。植物內(nèi)生細菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對宿主植物有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學(xué)作用[3-6]，根瘤內(nèi)生細菌也有類似的作用[7-9]。植物內(nèi)生細菌因具有多方面的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能，成為潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源，受到廣泛重視[10-11]。相對于植物其他組織部位的內(nèi)生細菌而言，關(guān)于根瘤內(nèi)生細菌的研究相對較少。

砂生槐（Sophora moorcroftiana），別稱西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏語名吉瓦，為豆科槐屬多年生矮灌木，是青藏高原特有種[12-13]。砂生槐灌叢主要分布在雅魯藏布江流域中段的寬谷、兩側(cè)低山及拉薩河、年楚河等主要支流的寬谷內(nèi)。作為典型的河谷灌叢，砂生槐具有良好的防風(fēng)固沙、涵養(yǎng)水源等重要生態(tài)作用[14-15]。目前關(guān)于砂生槐的研究主要集中在種群和群落結(jié)構(gòu)、繁殖特性、固沙特性和物種多樣性等方面[16-18]，迄今未見關(guān)于砂生槐根瘤內(nèi)生細菌及其促生性的研究報道。鑒于此，本研究以西藏砂生槐根瘤為研究材料，探討砂生槐根瘤內(nèi)生細菌資源多樣性及其促生潛力，為其在西藏荒漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與重建中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根瘤的采集

2017年5—7月分別從西藏米林縣、朗縣、加查縣、林周縣、白朗縣、拉薩市、日喀則市、貢嘎縣、扎囊縣等地采集盛花期和結(jié)莢期砂生槐根瘤樣品。將采集的結(jié)瘤砂生槐根部裝入無菌自封袋中，并置于裝有冰袋的塑料泡沫箱內(nèi)，帶回實驗室備用。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

本研究所用的培養(yǎng)基參照文獻[19]配制，其中甘露醇酵母汁（YMA）培養(yǎng)基用于根瘤內(nèi)生細菌的分離與純化;營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基用于細菌的活化培養(yǎng)與保存;阿須貝（Ashby）無氮培養(yǎng)基用于固氮菌的分離及固氮能力的測定;磷酸三鈣無機磷（PKO）培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷（PVK）培養(yǎng)基用于溶磷菌的分離及溶磷量的測定;無色氨酸King培養(yǎng)基[20]用于生長素分泌量的測定。S2比色液[21]。

1.3 砂生槐根瘤內(nèi)生細菌的分離與純化

砂生槐根瘤內(nèi)生細菌的分離與純化參照文獻[22]。首先用自來水將附著于砂生槐根瘤上的泥土沖洗干凈，放入75%乙醇中浸泡3 min，取出放入0.1%氯化汞溶液中進行表面滅菌3 min，再用無菌水洗滌5～6次，并將最后1次洗液涂布于YMA培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，若無菌落生成則表明根瘤表面消毒合格。將表面消毒合格的根瘤依次裝入盛有 0.5 mL 0.85% NaCl的離心管中，用已滅菌槍頭將其壓碎。吸取0.5 mL根瘤汁液均勻涂布于YMA培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置，28 ℃培養(yǎng)3～7 d。用劃線法進行純化，并將純化后的細菌轉(zhuǎn)接于NA斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 砂生槐根瘤內(nèi)生細菌遺傳多樣性分析

用NA液體培養(yǎng)基將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，按照黃寶靈等的方法[23]提取菌株總DNA，采用16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[24]進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物在 0.7%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化測序（上海英駿生物技術(shù)有限公司），將所測得的基因序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進行Blast相似性比對分析，然后用DNA分析軟件ClustalX 1.8進行多重序列比較，再用MEGA 5.0軟件通過鄰接法（neighbour-joining）建立系統(tǒng)進化樹。

1.5 砂生槐根瘤內(nèi)生細菌促生能力研究

1.5.1 溶磷能力測定 定性測定：采用溶磷圈法測定待測菌株的溶磷能力。定量測定：采用鉬銻抗比色法定量測定上清液中有效磷的含量和pH值[25]。

1.5.2 固氮能力 定性測定：將待測菌株菌懸液涂布在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察生長情況。定量測定：采用微量凱氏定氮法測定菌株的固氮量。固氮量根據(jù)以下公式[26]進行計算：

N=[（V1-V2）×14×1 000]/V。

式中：V1為樣品滴定時所用的0.005 mol/L標準硫酸溶液體積，mL;V2為空白滴定時所用的0.005 mol/L標準硫酸溶液體積，mL;14為1 mmol氮的質(zhì)量，mg;V為菌株培養(yǎng)液樣品體積，mL。

1.5.3 產(chǎn)IAA能力 采用Salkowski比色法[21]測定菌株分泌植物生長激素（IAA）的性能。Salkowskis（S2）比色液配制：FeCl3 4.5 g，溶于1 L 10.8 mol/L濃硫酸中。將0.3 mL菌懸液接種于盛有30 mL已滅菌無色氨酸King培養(yǎng)基中，在 28 ℃、150 r/min 恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)7 d，12 000 r/min離心 10 min，每菌株取0.1 mL上清液滴至檢測板上，加等量S2比色液，另取比色液0.1 mL，分別加入50、30、10 mg/L標準植物生長激素0.1 mL作梯度對照，室溫靜置15 min后觀察顏色變化，確定菌株是否具有分泌IAA的能力。取能夠分泌IAA菌株的上清液1 mL加入等量S2比色液中，于黑暗中靜置30 min后用紫外分光光度計在530 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算各菌株的IAA分泌量。

1.5.4 溶磷菌對砂生槐種子萌發(fā)的影響 將溶磷能力較高的菌株接種于PVK液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，備用。種子在處理前先用75%乙醇溶液浸泡3 min，再用0.1% HgCl浸泡5 min，然后用無菌水沖洗5～6次。用各菌株液體浸沒砂生槐種子（標準為剛好浸沒），處理4 h后倒掉處理液，陰干。將各處理的60粒種子（每皿20粒，3次重復(fù)）均勻放入鋪有3層無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，于 25 ℃ 條件下暗培養(yǎng)7 d。發(fā)芽期間每天定時噴灑無菌水2次并檢查種子發(fā)芽情況，以胚根伸出種殼長度達1/2種長為發(fā)芽標準，按下列公式計算發(fā)芽率：

發(fā)芽率=7 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離純化

通過劃線分離、革蘭氏染色鏡檢、菌落形態(tài)觀察等方法，從經(jīng)表面滅菌處理的砂生槐根瘤樣品中分離純化獲得45株砂生槐根瘤內(nèi)生細菌，通過形態(tài)特征和培養(yǎng)特征去重復(fù)后獲得19株代表菌株。

2.2 砂生槐根瘤內(nèi)生細菌的遺傳多樣性分析

對19株代表性菌株的16S rDNA基因片段進行序列測定，利用NCBI中的Blast對測序結(jié)果進行同源性比對搜索，運用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可以看出，砂生槐根瘤內(nèi)生細菌屬于5個不同的屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）8株、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）4株、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）3株、沙雷氏菌屬（Serratia）2株和普羅威登斯菌屬（Providencia）2株，其中，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌種，占所分離菌株的42.1%，與前人報道結(jié)果[27-28]相一致。

2.3 砂生槐內(nèi)生細菌體外促生指標測定結(jié)果

2.3.1 溶磷能力測定 本試驗測定了19株在無機磷和有機磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的砂生槐根瘤內(nèi)生細菌的溶磷圈直徑（D）和菌落生長直徑（d），并計算了相應(yīng)的D/d值。在PKO培養(yǎng)基上，供試的19株菌株中有7株菌株能夠產(chǎn)生溶磷圈，占供試菌株的36.8%，由表1可知，7株菌株的D/d值大小差異顯著，D/d值分布在1.3～3.3之間，其中菌株R1的D/d值最大，為3.3。在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上，6株菌株能夠產(chǎn)生溶磷圈，占供試菌株的31.6%，菌株的D/d值為 1.2～2.6（表2），其中菌株R2的D/d值最大，為2.6。為進一步確定各菌株溶磷能力的強弱，本研究利用鉬銻抗比色法定量檢測菌株溶磷能力。數(shù)據(jù)分析結(jié)果（表1、表2）顯示，在以磷酸鈣作為磷源的液體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7 d后7個菌株的溶磷量為100.06～128.71 mg/L，其中菌株R1的溶磷能力最強，達128.71 mg/L，其次是菌株R21，溶磷量為 122.80 mg/L，兩者溶磷量均與菌株R8溶磷量（最小溶磷量）之間差異顯著（P<0.05）。在以卵磷脂為唯一有機磷源的液體培養(yǎng)條件下，6株菌株的溶磷量范圍為42.60～92.70 mg/L，其中R24具有良好的溶解有機磷能力，溶磷量達 92.70 mg/L，其次是菌株R2，溶磷量為56.72 mg/L，兩者溶磷量均與菌株R7溶磷量（最小溶磷量）之間差異顯著（P<0.05）。通過上述分析得出，R7、R8和R10能同時降解無機磷和有機磷。

從表1、表2可以看出，在溶磷培養(yǎng)過程中，各菌株培養(yǎng)液的pH值均呈下降趨勢，由最初的7.00下降到4.7～5.3之間，下降了1.7～2.3個單位。

2.3.2 固氮能力測定 利用微量凱氏定氮法測定固氮菌株的固定氮量，部分菌株表現(xiàn)較強的固氮能力，培養(yǎng)7 d固定氮量達到44 mg/L以上，菌株間的固氮能力存在顯著差異（表3）。

2.3.3 IAA分泌特性 定性檢測結(jié)果（表4）顯示，有7株菌株呈現(xiàn)出色澤不同的紅色顯色反應(yīng)。從定量測定的結(jié)果看，菌株R17分泌IAA的能力最大，分泌量達49.22 μg/mL，與其余菌株的IAA分泌量之間具有顯著差異（P<0.05）;其次為菌株R20，IAA分泌量為48.40 μg/mL，與其余菌株的IAA分泌量之間均達到顯著差異水平（P<0.05）。IAA分泌能力的定性和定量分析結(jié)果基本一致，即在定性測驗中顯色效果明顯的菌株，對應(yīng)的IAA分泌量也比較高。

2.3.4 種子發(fā)芽結(jié)果 從圖2可以看出，除菌株R2、R10處理的發(fā)芽率小于對照外，菌株R7、R8、R16、R24均具有一定的促生效應(yīng)，和對照相比，對應(yīng)種子發(fā)芽率分別提高了20%、40%、40%和80%。

3 結(jié)論與討論

本研究通過YMA培養(yǎng)基從砂生槐根瘤內(nèi)分離到代表性內(nèi)生細菌19株，16S rDNA序列分析結(jié)果顯示，分離自砂生槐根瘤的內(nèi)生細菌分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）和普羅威登斯菌屬（Providencia），其中Bacillus屬為優(yōu)勢菌群，這與代金霞等關(guān)于根瘤內(nèi)生細菌的研究結(jié)果[11，28]一致。在19株內(nèi)生細菌中存在一些具有高效促進植物生長的特異菌株，這些菌株及菌株組合可用于西藏荒漠化地區(qū)的土壤改良和生態(tài)恢復(fù)等。

對比定量與定性測定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，溶磷圈法的準確度遠不及搖瓶復(fù)篩法，試驗中，在解無機磷細菌篩選過程中，很多在使用溶磷圈法測定時沒有溶磷能力的菌株，在復(fù)篩的過程中，發(fā)現(xiàn)其解磷能力較強。在解有機磷細菌篩選過程中發(fā)現(xiàn)，在卵磷脂平板上生長很好的菌株，放到搖瓶復(fù)篩時，其解磷能力很差，甚至沒有解磷能力，這與朱培淼等的報道[29-30]一致，因此，建議在菌株篩選過程中，通過D/d值篩選出的溶磷菌株必須通過液體培養(yǎng)法來進一步判斷其真實溶磷能力。

許多研究結(jié)果表明，影響根瘤菌與其宿主共生固氮的因素較為復(fù)雜，除遺傳因素起主導(dǎo)作用外，生態(tài)環(huán)境也有可能成為生物生存的重要調(diào)節(jié)因素[2，31-32]。陳文新等認為，根瘤菌與豆科植物之間的共生結(jié)瘤關(guān)系比較復(fù)雜，受多種因素影響，根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系涉及細菌、植物及環(huán)境3方面的相互作用[33]。在調(diào)查采樣中發(fā)現(xiàn)，并非所有地區(qū)的砂生槐都能夠結(jié)瘤，只在米林縣、朗縣和山南地區(qū)水分條件較好、由地表徑流沖刷形成的沖積溝底和兩旁灘地上的砂生槐根系中發(fā)現(xiàn)根瘤，而其他地區(qū)的砂生槐根系中沒有或極少著生有根瘤。這可能與青藏高原降水量少、蒸發(fā)強烈、氣候干燥、溫度較低等因素有關(guān)系，也可能與采樣時間對砂生槐不適宜有關(guān)，因此對影響砂生槐能否結(jié)瘤的因素還需進一步研究。

參考文獻：

[1]邱并生. 根瘤內(nèi)生細菌[J]. 微生物學(xué)通報，2013，40（3）：544.

[2]趙龍飛. 我國大豆根瘤內(nèi)生菌資源多樣性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（9）：15-19.

[3]Schulz B J，Boyle C.The endophytic continuum[J]. Mycological Research，2005，109（6）：661-686.

[4]饒小莉，沈德龍，李 俊，等. 甘草內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌株鑒定[J]. 微生物學(xué)通報，2007，34（4）：700-704.

[5]邱服斌，李雁津，張曉霞，等. 人參內(nèi)生細菌ge21菌株的鑒定及抑菌活性測定[J]. 微生物學(xué)通報，2010，37（1）：43-47.

[6]Zakhia F，Jeder H，Willems A，et al. Diverse bacteria associated with root nodules of spontaneous legumes in Tunisia and first report for nifH-like gene within the fenera Microbacterium and Starkeya[J]. Microbial Ecology，2006，51（3）：375-393.

[7]Li J H，Wang E T，Chen W F，et al. Genetic diversity and potential for promotion of plant growth detected in nodule endophytic bacteria of soybean grown in Heilongjiang Province of China[J]. Soil Biology and Biochemistry，2008，40（1）：238-246.

[8]Ibàez F，Angelini J，Taurian T，et al. Endophytic occupation of peanut root nodules by opportunistic Gammaproteobacteria[J]. Systematic and Applied Microbiology，2009，32（1）：49-55.

[9]龔明福，韓 松，李 超，等. 苦豆子根瘤內(nèi)生細菌分離及其對棉花枯萎病的生物防治效果測定[J]. 微生物學(xué)通報，2011，38（6）：865-870.

[10]姜 怡，楊 穎，陳華紅，等. 植物內(nèi)生菌資源[J]. 微生物學(xué)通報，2005，32（6）：146-147.

[11]代金霞，王玉炯，吳雪娟，等. 檸條根瘤內(nèi)生細菌的抗逆性及遺傳多樣性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23（2）：519-524.

[12]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會. 中國植物志：第40卷[M]. 北京：科學(xué)出版社，1994：77-78.

[13]張艷福，姚衛(wèi)杰，郭其強. 干旱脅迫對砂生槐種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，43（10）：45-56.

[14]彭躍明. 西藏雅魯藏布江中部流域砂生槐固沙作用研究[J]. 林業(yè)科技，1997，22（6）：6-8.

[15]趙墾田，楊小林，馬和平，等. 拉薩半干旱河谷砂生槐灌叢生態(tài)恢復(fù)過程的群落特征與土壤微生物動態(tài)分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2013，49（2）：15-20.

[16]王文娟，賀達漢，唐小琴，等. 不同溫度和沙埋深度對砂生槐種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 中國沙漠，2011，31（6）：1437-1442.

[17]楊兆平，沈渭壽，孫 明，等. 雅魯藏布江中游河谷風(fēng)沙化土地砂生槐群落結(jié)構(gòu)特征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2011，22（5）：1121-1126.

[18]崔光帥，張 林，沈 維，等. 西藏雅魯藏布江流域中段砂生槐灌叢生物量分配及碳密度[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2017，41（1）：53-61.

[19]李振高，駱永明，滕 應(yīng). 土壤與環(huán)境微生物研究法[M]. 北京：科學(xué)出版社，2008：52-125.

[20]張 英，朱 穎，姚 拓，等. 分離自牧草根際四株促生菌株（PGPR）互作效應(yīng)研究[J]. 草業(yè)學(xué)報，2013，22（1）：29-37.

[21]曾慶飛，王 茜，陸瑞霞，等. 大豆根際促生菌的分離篩選及其對大豆和百脈根生長與品質(zhì)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報，2017，26（1）：99-111.

[22]丁雅迪，熊 智，王明月，等. 文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤內(nèi)生細菌多樣性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，46（4）：602-608.

[23]黃寶靈，呂成群，武 波，等. 一株分離自裸子植物羅漢松根瘤的根瘤菌[J]. 中國科學(xué)（C輯：生命科學(xué)），2007，37（1）：52-57.

[24]Monis P T，Glglio S，Saint C P.Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis[J]. Analytical biochemistry，2005，340（1）：24-34.

[25]Liu X X，Wang X L，Lu R X. Phosphorus solubilizing capability，IAA secretion and characteristics of phosphorus-solubilizing bacteria in rhizosphere of alfalfa in Guizhou Province[J]. Agricultural Science & Technology，2012，13（12）：2554-2559，2576.

[26]胡春錦，林 麗，史國英，等. 廣西甘蔗根際高效聯(lián)合固氮菌的篩選及鑒定[J]. 生態(tài)學(xué)報，2012，32（15）：4745-4752.

[27]龔明福，馬玉紅，李 超，等. 苦豆子根瘤內(nèi)生細菌分離及表型多樣性分析[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（2）：408-411.

[28]鐘宇舟，余秀梅，陳 強，等. 四川盆地大豆根瘤內(nèi)生細菌的分離鑒定及促生效果[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2017，23（1）：46-53.

[29]朱培淼，楊興明，徐陽春，等. 高效解磷細菌的篩選及其對玉米苗期生長的促進作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2007，18（1）：107-112.

[30]郭藝鵬，王海儒，孫林琦，等. 棗根際解磷細菌的分離篩選及16S rDNA鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，49（6）：811-816，837.

[31]趙龍飛，鄧振山，楊文權(quán)，等. 我國西北部分地區(qū)豆科植物根瘤菌資源調(diào)查研究[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2009，27（6）：33-39.

[32]何恒斌，賈昆峰，賈桂霞，等. 沙冬青根瘤菌的抗逆性[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2006，30（1）：140-146.

[33]陳文新，汪恩濤，陳文峰. 根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環(huán)境的關(guān)系[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（1）：81-86.