苗玉發(fā)，康慧君，王 超，張河戰(zhàn)

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176)

已上市藥物撤市最常見(jiàn)的單一原因是藥物誘導(dǎo)的肝毒性。然而，大多數(shù)因肝毒性撤市的藥物如酮康唑、溴芬酸、異丙異煙肼和曲列格酮等，在治療劑量下導(dǎo)致肝衰竭的發(fā)生率不超過(guò)萬(wàn)分之一。在藥物開(kāi)發(fā)階段，盡管進(jìn)行了詳細(xì)的臨床前毒性研究和人體臨床研究，也很少能發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重肝毒性的病例。因此，如果能在肝臟發(fā)生不可逆損傷之前，用靈敏度較好的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)即將發(fā)生的嚴(yán)重肝毒性，及時(shí)調(diào)整用藥或停藥，則有可能避免進(jìn)一步的肝損傷。本研究構(gòu)建3種肝毒性模型，評(píng)價(jià)潛在的新型肝毒性生物標(biāo)志物血清維 生素D結(jié)合蛋白(vitamin D binding protein，VDBP)和其它常用肝毒性指標(biāo)對(duì)肝毒性的診斷價(jià)值，以期找到更加靈敏的診斷指標(biāo)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠128只，7周齡，160～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物在中國(guó)食品藥品檢定研究院安全評(píng)價(jià)研究所SPF級(jí)屏障系統(tǒng)[SYXK(京)2016-0045] 中飼養(yǎng)，每籠1～3只，自由攝食和飲水。解剖前16～18h禁食，正常供水?；\具采用PC聚碳酸酯鼠盒(L×W×H：294 mm×190 mm×125 mm)，每周更換2～3次。飼養(yǎng)室12 h照明，保持21℃～24℃的溫度，31%～64%的濕度和每小時(shí)10～20次以上的換氣次數(shù)。研究遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”原則，并保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)有的福利。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)號(hào)：IACUC2014026。

1.2 試劑和儀器 7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)，5810R型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，200 mg酮康唑(KTZ)片劑(西安楊森制藥公司)，四氯化碳(CCl4)(北京化工廠)；500 mg對(duì)乙酰氨基酚(APAP)片劑(青島黃海制藥有限責(zé)任公司)，大鼠VDBP試劑盒(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、總膽汁酸(TBA)、膽堿酯酶(CHE)和5’核苷酸酶(5’-NT)試劑和校準(zhǔn)品均購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。谷氨酸脫氫酶(GLDH)、單胺氧化酶(MAO)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)試劑和校準(zhǔn)品均購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 CCl4肝毒性模型的構(gòu)建[1]：CCl4用精制花生油配制成30 ml/dl的溶液，使用當(dāng)天配制。實(shí)驗(yàn)設(shè)置CCl4組和正常對(duì)照組。CCl4組32只大鼠，正常對(duì)照組8只大鼠。30%(v/v)CCl4給藥體積為10 ml/kg，灌胃給藥，共給藥1次。給藥結(jié)束后2，4，6和7h分別解剖8只動(dòng)物。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水1次后7 h解剖8只動(dòng)物。

1.3.2 KTZ肝毒性模型的構(gòu)建：KTZ片劑直接溶于注射用水充分混勻配成40 mg/ml混懸溶液，放置冰箱冷藏備用，使用前充分混勻。實(shí)驗(yàn)設(shè)置KTZ組和正常對(duì)照組。KTZ組48只大鼠，正常對(duì)照組8只大鼠。KTZ給藥劑量為225 mg/kg，灌胃給藥，每天給藥1次，共給藥8次。第一次給藥設(shè)為第0天，在1，2，3，4，6和8天，分別解剖8只動(dòng)物，解剖動(dòng)物當(dāng)天不給藥。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水1次后第8天解剖8只動(dòng)物。

1.3.3 APAP肝毒性模型的構(gòu)建[2]：APAP片劑直接溶于注射用水充分混勻配成200 mg/ml混懸溶液，放置冰箱冷藏備用，使用前充分混勻。實(shí)驗(yàn)設(shè)置APAP組和正常對(duì)照組。APAP組24只大鼠，正常對(duì)照組8只大鼠。APAP給藥劑量為2 g/kg，灌胃給藥，共給藥1次。給藥結(jié)束后4，8和24 h分別解剖8只動(dòng)物。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水1次后24 h解剖8只動(dòng)物。

1.3.4 動(dòng)物解剖、血清制備及指標(biāo)檢測(cè)：動(dòng)物用50 mg/kg硫噴妥鈉麻醉后，腹腔大靜脈取血2～3 ml，室溫靜置約40 min后，3 000 r/min離心，吸取上層血清用于指標(biāo)檢測(cè)。ALT，AST，ALP，TBIL，TBA，CHE，GLDH，5’-NT，MAO和MDH等指標(biāo)用7180型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。VDBP用ELISA試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2結(jié)果

2.1 CCl4肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，ALT，AST，TBIL和CHE在CCl4給藥后4 h起升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GLDH，MAO和MDH在給藥后6 h起升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALP，TBA和5’-NT與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VDBP濃度在CCl4給藥后2 h起降低，并一直持續(xù)到7 h，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CCl4肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2 KTZ肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，ALT在KTZ給藥6天后升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AST和TBIL在給藥后8天升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALP，TBA，CHE，GLDH，5’-NT，MAO和MDH在給藥后任何時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。VDBP濃度在KTZ給藥后1天起降低，并一直持續(xù)到第8天，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 KTZ肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 APAP肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，ALP在APAP給藥后4 h和8 h點(diǎn)升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。CHE在給藥后8 h點(diǎn)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALT和TBIL在給藥后24 h點(diǎn)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AST，TBA，GLDH，5'-NT，MAO和MDH在給藥后任何時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。VDBP濃度在APAP給藥后第4 h起降低，并一直持續(xù)到24 h，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論肝細(xì)胞損傷最傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物是血清ALT。肝損傷時(shí)肝細(xì)胞被破壞，細(xì)胞內(nèi)的ALT釋放入血，導(dǎo)致血清中ALT含量升高。AST在肝臟和心肌中均大量存在，肝損傷時(shí)，AST也一定程度升高。但AST的生物分布決定AST升高未必是由于肝損傷引起，心肌細(xì)胞損傷同樣也能導(dǎo)致AST升高[3-4]。本研究在KTZ和APAP肝毒性模型中，ALT的特異度和靈敏度都優(yōu)于AST。在CCl4肝毒性模型中，由于CCl4的劑量大，毒性強(qiáng)，所有動(dòng)物都出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝損傷，所以ALT和AST都顯示相當(dāng)?shù)脑\斷價(jià)值。

表3 APAP肝毒性模型中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

ALP常以同工酶的形式存在于多個(gè)組織中，但血清中的ALP主要來(lái)自肝臟、骨骼和腸道。ALP在膽汁淤積時(shí)升高較為明顯，是診斷膽汁淤積的敏感指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在肝癌患者血清中ALP也顯著性升高[5]。TBA是由膽固醇轉(zhuǎn)化而來(lái)，在膽囊中儲(chǔ)存和濃縮，并釋放到腸道中幫助消化食物。TBA可以通過(guò)肝腸循環(huán)被重復(fù)利用，當(dāng)肝腸循環(huán)受阻或肝膽系統(tǒng)病變，血清中的TBA就會(huì)升高。5’-NT僅由肝臟合成，因此對(duì)于肝臟病變的診斷具有較好的特異度。文獻(xiàn)顯示，5’-NT活性在梗阻性黃疸和肝癌患者中均升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在肝硬化患者中的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。本研究中所構(gòu)建的3種急性肝毒性模型，均以肝細(xì)胞損傷為主，未出現(xiàn)膽道梗阻或膽汁淤積現(xiàn)象，因此，與對(duì)照組相比，ALP，TBA和5’-NT在給藥后各時(shí)間點(diǎn)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在APAP肝毒性模型中4 h和8 h時(shí)間點(diǎn)ALP降低沒(méi)有實(shí)際的臨床意義，可能與動(dòng)物禁食有關(guān)。

CHE主要存在于肝臟、紅細(xì)胞和腦中，大鼠肝臟損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜破壞，血清中的CHE會(huì)升高?？偰懠t素是血紅蛋白的分解產(chǎn)物，包括直接膽紅素和間接膽紅素。資料顯示，肝硬化患者中TBA和TBIL水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明血清中TBA和TBIL濃度變化與肝實(shí)質(zhì)損害程度密切相關(guān)[7-8]。本研究在3種肝毒性模型中，TBIL僅在最末次時(shí)間點(diǎn)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明TBIL在這3種模型中預(yù)測(cè)肝毒性的靈敏度不足。CHE在KTZ肝毒性模型中的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在APAP肝毒性模型中僅有8 h時(shí)間點(diǎn)升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)CHE在KTZ和APAP肝毒性模型中診斷肝損傷的價(jià)值不高。

GLDH是一種線粒體酶，肝臟、心肌及腎臟含量豐富，肝細(xì)胞損傷可導(dǎo)致血清中GLDH含量升高。MAO活性高低能反映肝纖維化的程度，是診斷肝硬化的重要指標(biāo)。各種肝炎急性期患者血清MAO不增高，但暴發(fā)性重癥肝炎或急性肝炎中有肝壞死時(shí)，血清MAO活性可升高[9-10]。MDH是一種氧化還原酶，可催化草酰乙酸和蘋(píng)果酸之間的可逆性轉(zhuǎn)化，主要參與三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、蘋(píng)果酸-天冬氨酸循環(huán)等代謝途徑。MDH在肝臟中含量豐富，以線粒體和胞漿中分布居多。當(dāng)肝臟損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDH釋放入血導(dǎo)致外周血中MDH含量增加。MDH常用于心肌梗塞、急性實(shí)質(zhì)性肝損傷、肝癌、肺癌的早期診斷用酶[11]。本研究中，GLDH，MAO和MDH在CCl4肝毒性模型中，給藥后6 h升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有一定的診斷價(jià)值，而在KTZ和APAP肝毒性模型中的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)法預(yù)測(cè)肝毒性的發(fā)生，不具有診斷價(jià)值。

大鼠VDBP主要由肝臟合成和分泌，是一種分子量約為52～54kDa的酸性糖蛋白，在維生素D甾醇類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。VDBP不但能與血液中維生素D及其代謝產(chǎn)物25(OH)D特異性結(jié)合，還能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，阻止肌動(dòng)蛋白的聚合[12]。臨床上，肝纖維化和肝癌患者外周血中VDBP的含量較低，且降低的水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。本研究在3種肝毒性模型中，從給藥后第一個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始，VDBP降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這證實(shí)VDBP在這3個(gè)肝毒性模型中比其它所有指標(biāo)都具有較好的靈敏度，可以更早期的預(yù)測(cè)這3種模型中的肝細(xì)胞損傷。綜上所述，VDBP作為潛在的肝毒性生物標(biāo)志物具有很好的診斷價(jià)值，可以繼續(xù)在更多的肝毒性模型中進(jìn)行驗(yàn)證。