張愛瓊 ，梁海英，曾智勇 （編譯）

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬一種雙鏈DNA病毒。常引起豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率高，病死率可高達(dá)100%。最近，非洲豬瘟病毒在歐盟國家和中國暴發(fā)流行，嚴(yán)重威脅著畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于目前沒有有效的疫苗和抗病毒藥物對其進(jìn)行控制，使其進(jìn)一步暴發(fā)蔓延成為可能?；诜侵挢i瘟疫情的暴發(fā)與流行，Hakobyan A 等對抗ASFV 的有效抗病毒藥物進(jìn)行了研究。

芹菜素是一種植物來源的黃酮類化合物，該化合物以其生物活性而聞名，包括對丙型肝炎病毒、腸道病毒-71 和口蹄疫病毒的抗病毒作用。然而，芹菜素在化學(xué)上是不穩(wěn)定的并且?guī)缀醪蝗苡诟邩O性溶劑，例如水，在植物中它通常以衍生形式存在。Hakobyan A 等在研究中為評估商業(yè)上可獲得的芹菜素衍生物（葡糖基化或甲基化）對ASFV 的抗病毒活性，對金合歡素（Acacetin）、芹黃素葡糖苷（Apigetrin）、芫花素（Genkwanin）、野 漆 樹 甙（Rhoifolin）、 牡 荊 素(Vitexin)、牡荊素-2-O-鼠李糖苷（Vitexin-2-O-rhamnoside） 六 種 化合物（結(jié)構(gòu)式見圖1A）進(jìn)行了測試。其首先通過使用MTT[溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑]測定，在Vero 細(xì)胞（體外ASFV 感染的細(xì)胞）中篩選芹菜素衍生物的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示這6 種化合物可根據(jù)其細(xì)胞毒性特征分為兩組，野漆樹甙和芹黃素葡糖苷表現(xiàn)出很高的細(xì)胞毒性，表明C7 位的碳水化合物部分可能增加芹菜素衍生物的體外毒性。相比其余四種化合物，其中芫花素（595.1±45.5μM）和牡荊素-2-O-鼠李糖苷（409.1±50.2μM）顯示出比金合歡素（659.1±25.9μM）和牡荊素（783.5±64.5μM） 略 高 的 毒 性（圖1B）。同時在MEM 中制備的工作溶液中沒有觀察到DMSO 濃度（＜1%）的細(xì)胞毒性。

為了測試芹菜素衍生物是否具有抗ASFV 的抗病毒活性，其用ASFV/Ba71V 感染在96 孔培養(yǎng)板中生長的Vero 細(xì)胞，用芹菜素衍生物（每個化合物6 個孔）處理，金合歡素和牡荊素的濃度為20 μM，芫花素和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的濃度為40 μM，感染進(jìn)行了96 h，直到處理的細(xì)胞中發(fā)生總細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。收集上清液并通過基于CPE 的測定滴定，滴度通過Spearman-K?rber 終點(diǎn)法計算并表示為TCID50/ml。結(jié)果顯示，在所選擇的四種化合物中，只有芫花素顯著降低病毒滴度從6.5±0.1到4.75±0.25 log TCID/ml（圖1C）?；谀承S酮類化合物對DNA 和RNA 病毒具有直接地殺病毒活性，其首先進(jìn)行了芫花素對細(xì)胞外ASFV 顆粒的影響研究，結(jié)果顯示處理和未處理的Vero 細(xì)胞之間病毒滴度的差異在統(tǒng)計學(xué)上是不顯著的，表明芫花素不能損害細(xì)胞外病毒顆粒。在細(xì)胞進(jìn)入之前排除了芫花素的殺病毒活性。同時其對ASFV 病毒的附著和內(nèi)化進(jìn)行了測定，結(jié)果表明芫花素能夠干擾ASFV 感染的附著和內(nèi)化階段，這與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞密切相關(guān)并且是必需的，但確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究探索。由于ASFV向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于微管，秋水仙堿和諾考達(dá)唑等微管蛋白聚合抑制劑能夠抑制細(xì)胞中ASFV 的釋放，通過研究后推測芫花素可能通過破壞沿著微管的病毒運(yùn)動來抑制ASFV 從宿主細(xì)胞中的排出。

為了進(jìn)一步證實其抗病毒效果，測定了用芫花素處理后ASFV細(xì)胞中病毒DNA 的數(shù)量。即將生長在蓋玻片上并用ASFV/Ba71V 菌株（2TCID50/細(xì)胞）感染的Vero 細(xì)胞暴露于濃度為10、20、40 μM 的芫花素中。在感染后16 h，將細(xì)胞在96%乙醇溶液中固定30 min，并通過Feulgen 的方法在新鮮的希夫氏試劑中染色。通過計算機(jī)配備的顯微鏡-細(xì)胞儀在575 nm 處測量病毒細(xì)胞的DNA 含量，并表示為集成光學(xué)密度（IOA）。結(jié)果顯示，在處理的Vero 細(xì)胞中，ASFV 含量顯著少于模擬處理細(xì)胞中的，表明40 μM 濃度的芫花素也可能阻礙病毒DNA 復(fù)制。當(dāng)ASFV 感染的細(xì)胞暴露于芹菜素和染料木黃酮時獲得了類似的結(jié)果。

圖1 芹菜素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（A），細(xì)胞毒性（B）和抗ASFV 活性（C）

通過免疫印跡分析評估了在芫花素存在下早期（p32）和晚期（p72）病毒蛋白的表達(dá)，即在70 mm 培養(yǎng)皿中生長的Vero 細(xì)胞用ASFV/Ba71V 分離物感染，在吸附期后暴露于濃度為10、20、40 μM 的芫花素中。在蛋白質(zhì)提取之前，將細(xì)胞在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的冰冷改良RIPA緩沖液中裂解。使用聚丙烯酰胺分離凝膠對澄清的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳并通過電印跡轉(zhuǎn)移至0.2 μm 孔徑的硝酸纖維素膜上。用封閉液在室溫下封閉1 h 后，與特異性一抗孵育1 h，然后將膜與帶有HRP 的適當(dāng)?shù)亩乖谑覝叵路跤? h，最后用PBST 洗滌3 次，并用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，經(jīng)40 μM 濃度的芫花素處理后，兩種蛋白質(zhì)的合成均顯著降低，且較低濃度的芫花素的存在也對晚期但非早期蛋白質(zhì)的合成有影響，表明該化合物可能主要通過未知機(jī)制干擾晚期ASFV 基因的表達(dá)。

在豬中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是ASFV 感染的主要目標(biāo)。因此，進(jìn)行了實驗來確定芫花素對豬巨噬細(xì)胞中毒性ASFV 分離株（亞美尼亞/07）的影響。用與Vero 細(xì)胞實驗相同的芫花素濃度（40 μM）處理ASFV 感染的巨噬細(xì)胞，將巨噬細(xì)胞接種在96 孔板中，并通過血細(xì)胞吸附（HAD）測定進(jìn)行滴定。測定顯示，在感染的早期或晚期加入芫花素后，ASFV 的產(chǎn)率顯著降低。兩個階段芫花素的影響表明，其可以阻止病毒進(jìn)入和離開豬巨噬細(xì)胞。在病毒附著步驟中用芫花素處理豬巨噬細(xì)胞導(dǎo)致ASFV 產(chǎn)量從5.0±0.3 log HADU50/ml 降低至3.6±0.2 log HADU50/ml。當(dāng)在ASFV感染的內(nèi)化階段加入芫花素時，也觀察到顯著的抗病毒效果。病毒出口測定顯示，在豬巨噬細(xì)胞中第一輪ASFV 感染后釋放的病毒后代減少了1.2 log。這些結(jié)果表明，芫花素不僅能夠抑制ASFV Ba71V，還能夠抑制現(xiàn)在在歐洲和中國流行的高毒性ASFV 分離株。

總之，現(xiàn)已將芫花素鑒定為有效的抗ASFV 化合物，其靶向病毒進(jìn)入和離開感染階段。芫花素可以抑制豬巨噬細(xì)胞中高毒性ASFV 分離株的復(fù)制，這強(qiáng)調(diào)了其作為抗病毒藥物開發(fā)候選物的價值。這是關(guān)于芫花素體外抗病毒活性的第一份報告，表明未來的研究可能擴(kuò)大其作為抗病毒劑對抗其他病毒的應(yīng)用范圍。