云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650011

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen)為五加科人參屬植物，是我國(guó)名貴中藥材，是云南道地中藥材資源。血塞通注射液為三七提取物制劑，主要成份為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效，主要用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)證，動(dòng)脈粥狀硬化性血栓性腦梗塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞見(jiàn)瘀血阻絡(luò)證者，臨床應(yīng)用廣泛并且療效確切，是一種具有重要應(yīng)用前景的中藥品種。血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001(Z)-2011，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量測(cè)定所用方法為HPLC法[1]，檢測(cè)時(shí)間為60min，耗時(shí)較長(zhǎng)而且靈敏度低。其主要成分三七總皂苷和三七三醇皂苷的含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法收載于《中國(guó)藥典》2015版[2、3]，三七三醇皂苷的測(cè)定也采用HPLC法，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為90分鐘。LC-MS/MS技術(shù)是近年最新發(fā)展起來(lái)的重要的分離和分析方法，擁有液相色譜的優(yōu)越分離性能，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)相較于單質(zhì)譜(MS)具有更高選擇性、更高靈敏度和更高準(zhǔn)確度，LC-MS/MS具有分析范圍廣，分離能力強(qiáng)，定性分析結(jié)果可靠，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)能夠避免繁瑣和復(fù)雜的衍生化前處理，同時(shí)能夠得到化合物保留時(shí)間、分子量及特征離子對(duì)等豐富的信息。在對(duì)未知成分的研究中，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)器給出的大量結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類(lèi)已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，即可對(duì)未知成分進(jìn)行分析；在已知成分的測(cè)定中，相較于傳統(tǒng)色譜法具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度[5]。檢索現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)，對(duì)血塞通注射液進(jìn)行有效成分測(cè)定的方法多為液相色譜法[6-13]，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)最短為24min[7]，應(yīng)用LC-MS/MS測(cè)定三七總皂苷中一個(gè)或幾個(gè)皂苷成分的研究文獻(xiàn)也有報(bào)道，但研究對(duì)象為三七原料[14-15]或其他品種的注射液[16]，應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)血塞通注射液中三七總皂苷進(jìn)行測(cè)定的文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。研究建立一種運(yùn)用LC-MS/MS法對(duì)血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1快速準(zhǔn)確定量的方法，相對(duì)于血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大大提高了檢測(cè)效率。并成功運(yùn)用該方法對(duì)來(lái)自云南不同生產(chǎn)企業(yè)的血塞通注射液進(jìn)行了含量測(cè)定，為云南血塞通注射液的生產(chǎn)企業(yè)提供了提升藥品標(biāo)準(zhǔn)、提高藥品質(zhì)量的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-30A高效液相色譜儀(含在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司)、TRIPLE QUAD 5500型質(zhì)譜儀(美國(guó) AB Sciex公司)、CPA225D 型分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)、UPH-IV-90Z優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)。

1.2 材料 人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1，批號(hào)：110703-201529，純度95.0%)、人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1，批號(hào)：110704-201424，純度93.7%)、人參皂苷Re(Ginsenoside Re，批號(hào)：110754-201525)、人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd，1批號(hào)：10704-201424)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，批號(hào)：110745-201318)和三七總皂苷(Notoginseng Total Saponins，批號(hào)：110870-201002，含量以三七皂苷R1 6.9%、人參皂苷Rg1 28.0%、人參皂苷Rb1 29.7%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rd 7.3%計(jì))以上對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜級(jí)，德國(guó)默克公司)，乙腈(色譜級(jí)，德國(guó)默克公司)，超純水。血塞通注射液收集于云南省不同企業(yè)，具體見(jiàn)表1。各待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL CORE C18柱(2.1 mm I.D.×150 mm, 2.7 μm，SHISEIDO)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相： A-B(水-乙腈)梯度洗脫，梯度洗脫程序如下,見(jiàn)表2；分析時(shí)間為 15.0 min；流速：0.300 mL/min；進(jìn)樣量：1.00 μL。對(duì)照品的提取 MRM 色譜圖和樣品的MRM色譜圖比對(duì)見(jiàn)圖2。

表2 液相系統(tǒng)梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的掃描方式下正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，離子源為 ESI 源，源噴射電壓設(shè)置為 5500 和-4500 V，源溫度(TEM)550℃，霧化氣壓力為55 psi，接口持續(xù)加熱，碰撞反應(yīng)氣使用氮?dú)?，氣簾氣壓力?35 psi，Q1 和 Q3 分辨率均為 0.1 Da，駐留時(shí)間(dwell time)為 80 ms。

將每個(gè)皂苷成分的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對(duì)照品溶液(濃度約1 μg/mL)分別打入質(zhì)譜中，用MRM模式正負(fù)離子同時(shí)掃描，對(duì)前體離子(Q1)、產(chǎn)物離子(Q3)、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，五種皂苷成分的響應(yīng)強(qiáng)度均優(yōu)于負(fù)離子的響應(yīng)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)采用正離子對(duì)定量、負(fù)離子對(duì)定性的方式對(duì)五種皂苷成分進(jìn)行測(cè)定。由于負(fù)離子對(duì)不用于定量檢測(cè)，所以未對(duì)負(fù)離子對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。正離子模式下的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)見(jiàn)表3。數(shù)據(jù)處理采用 AB Sciex公司提供的 Analyst軟件，1.6版本。五種皂苷成分的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的主要裂解碎片見(jiàn)表3和圖3。

表3 五種皂苷成分的LC-MS/MS數(shù)據(jù)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對(duì)照品適量，使用甲醇溶解并配制成一定濃度的貯備液，供質(zhì)譜條件優(yōu)化用。取三七總皂苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并定容，制得三七總皂苷儲(chǔ)備液，濃度為含三七總皂苷1.0775 mg/mL。于-20 ℃下保存。

2.3 供試品溶液的制備 取血塞通注射液適量，按照一定比例，用甲醇稀釋定容后，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后制得供試品溶液，于4 ℃下保存。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限 取三七總皂苷儲(chǔ)備液，采用梯度稀釋法，用甲醇由高到低分別稀釋成8個(gè)濃度(4310 ng/mL，2155 ng/mL，1077.5 ng/mL，538.75 ng/mL，269.38 ng/mL，134.69 ng/mL，67.34 ng/mL)，0.45 μm濾膜過(guò)濾后，取1.0 μL進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將三七總皂苷儲(chǔ)備液用甲醇逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N=10和S/N=3時(shí)各對(duì)照品溶液的濃度為定量限和檢測(cè)限。

2.4.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 取血塞通注射液，按照適當(dāng)比例稀釋?zhuān)玫街虚g液，再將中間液用兩倍的稀釋梯度稀釋為高、中、低三個(gè)不同濃度的供試液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，取1μl進(jìn)樣，每個(gè)濃度的供試液平行測(cè)定6份，按“2.1”項(xiàng)下的分析條件對(duì)供試液中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1進(jìn)行定量分析記錄峰面積，帶入當(dāng)日制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出5個(gè)皂苷的濃度，并計(jì)算RSD值。供試液于4 ℃下保存，于24 h后同法再次測(cè)定，計(jì)算出5個(gè)皂苷的濃度，并計(jì)算RSD值。

取供試品溶液，于4 ℃下保存，分別于0 h、24 h、48 h 測(cè)定五種皂苷的濃度，平行測(cè)定6份，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

精密量取供試品溶液1.0 mL，加入甲醇1.0 mL旋渦混勻后，取1.0 μL進(jìn)樣，測(cè)定五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算濃度(記錄為A濃度)。精密量取高、中、低(4156 ng/mL、2078 ng/mL、1039 ng/mL)三個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液1.0 mL，分別加入到1.0 mL的供試品溶液中，旋渦混勻后，制得含有高、中、低濃度的三七總皂苷的供試品加樣回收溶液(外加對(duì)照品的濃度值為2078 ng/mL、1039 ng/mL、519 ng/mL)，每個(gè)濃度平行制備 6 份進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定供試品加樣回收溶液中五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出五種皂苷在加樣回收溶液中的含量(記錄為B濃度)，B濃度與A濃度的差值即為實(shí)測(cè)的對(duì)照品濃度值。帶入按回收率公式：實(shí)測(cè)的對(duì)照品濃度值/外加對(duì)照品的濃度值×100%。計(jì)算五種皂苷的回收率。

2.5 樣品中五種皂苷成分含量測(cè)定 分別取“表1”中9個(gè)批次的血塞通注射液作為樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄五種皂苷的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中五種皂苷的成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。相關(guān)系數(shù)為r>0.9988 ，線性關(guān)系良好，所得回歸方程、線性范圍、LOD 和 LOQ 見(jiàn)表4。

表4 五種皂苷成分的回歸方程、線性范圍、LOD和LOQ

3.1.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 5 種皂苷的日內(nèi)精密度及日間精密度的RSD值分別小于 4.14%和 4.87%，說(shuō)明方法精密度良好，詳見(jiàn)表5和表6。供試品溶液于4 ℃下保存，分別于0 h、24 h、48 h 測(cè)定五種皂苷的濃度，結(jié)果顯示供試品溶液穩(wěn)定性較好，RSD≤7.32%，具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表7。5 種皂苷低、中、高 3 種濃度的加樣回收率范圍為 94.02%～106.20%，表明方法回收率良好。

表5 血塞通注射液中五種皂苷成分測(cè)定的日內(nèi)和日間精密度

表6 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果 (n=6)

表7 高中低不同濃度供試液的回收率考察 (n=6)

3.2 血塞通注射液樣品中的五種皂苷成分的含量測(cè)定9批血塞通注射液中的的五種皂苷成分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。其中人參皂苷Rg1的含量范圍為28.39%～37.48%、人參皂苷Rb1的含量范圍為28.75%～43.01%、人參皂苷Rd的含量范圍為6.11%～11.53%、人參皂苷Re的含量范圍為2.945～6.10%、三七皂苷R1的含量范圍為5.82%～9.29%。由此可看出云南地產(chǎn)的，不同企業(yè)、不同批次的血塞通注射液中的五種皂苷成分的含量范圍跨度不大，且都符合現(xiàn)行血塞通注射液藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001(Z)-2011”的要求。來(lái)自同一生產(chǎn)企業(yè)的不同生產(chǎn)批號(hào)的血塞通注射液的五種皂苷成分的含量范圍差異較小，可見(jiàn)生產(chǎn)工藝都較為成熟穩(wěn)定。

表8 血塞通注射液中五種皂苷成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

4 討論

人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1五種成分的對(duì)照品均使用甲醇溶解后，直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行調(diào)諧，結(jié)果顯示負(fù)離子模式下，每個(gè)被分析物均有2～3對(duì)特征離子對(duì)，詳見(jiàn)表9。而在正離子模式下，每個(gè)被分析物都只有一對(duì)信號(hào)響應(yīng)較好的特征離子對(duì)。綜合比較每個(gè)被分析物正負(fù)離子對(duì)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1 在正離子模式下的離子對(duì)響應(yīng)值均比負(fù)離子模式下的離子對(duì)響應(yīng)值高，所以采用正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，用正離子對(duì)進(jìn)行定量，負(fù)離子對(duì)用來(lái)定性的方式對(duì)血塞通注射液中5中皂苷成分進(jìn)行測(cè)定。因人參皂苷Rd和人參皂苷Re是同分異構(gòu)體，在正離子模式下，擁有幾乎相同的離子對(duì)，僅依靠質(zhì)譜是無(wú)法通過(guò)提取檢測(cè)離子對(duì)來(lái)對(duì)人參皂苷Rd和人參皂苷Re分別單獨(dú)定量的，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)液相色譜的條件進(jìn)行探索，選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm,Waters)和CAPCELL CORE C18色譜柱(2.1 mm I.D.×150 mm, 2.7 μm，SHISEIDO)試圖對(duì)5種皂苷成分進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在同樣的洗脫順序下，CAPCELL CORE C18色譜柱在9分鐘內(nèi)將人參皂苷Rd(保留時(shí)間8.87 min)和人參皂苷Re(保留時(shí)間7.49 min)分離開(kāi)來(lái)，而ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱無(wú)法分離5個(gè)皂苷成分(5個(gè)成分保留時(shí)間均在5.3 min左右)，若要提高分離度需要增加流動(dòng)相的洗脫梯度，時(shí)測(cè)定時(shí)間延長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)選擇CAPCELL CORE C18色譜柱。

三七總皂苷作為血塞通注射液的主要有效成分，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1。每一個(gè)成分都有其獨(dú)特的藥理活性，其中人參皂苷作為主要成分，具有天然抗氧化作用，大量的研究表明人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都有影響，可以抑制細(xì)胞凋亡、擴(kuò)張血管、抗衰老，并對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的恢復(fù)有一定作用[17]。人參皂苷Rb1具有促智作用、心血管保護(hù)作用、降血糖的作用[18]。人參皂苷Re具有抗心肌缺血、作用，可影響心肌細(xì)胞的CYP450酶和ANP基因的表達(dá)[19]。人參皂苷Rd能夠發(fā)揮抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[20]。三七皂苷R1具有抗炎，防止缺血再灌注損傷的作用[21]。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)來(lái)自3家云南不同企業(yè)的共計(jì)9批血塞通注射液進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示三七總皂苷含量跨度較大，最低78.67%，最高95.30%，且同一生產(chǎn)企業(yè)不同批號(hào)間的三七總皂苷含量以及每個(gè)皂苷組分的含量都有明顯差異(詳見(jiàn)表8)，說(shuō)明生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于原料的質(zhì)量控制及投料工藝還有改進(jìn)優(yōu)化的空間。再者，因?yàn)椴煌脑碥斩加衅洳煌乃幚砘钚?，今后可否將三七總皂苷中每一種皂苷成分單獨(dú)作為原料來(lái)研發(fā)新的三七制劑，這樣可以制造出適應(yīng)癥更確切，質(zhì)量更加便于控制的三七制劑，真正運(yùn)用到做到中藥現(xiàn)代化發(fā)展中。

血塞通注射液的主要輔料為氯化鈉，由于無(wú)機(jī)鹽離子在質(zhì)譜中無(wú)法被氣化，在高溫下容易附著于離子源管路中，對(duì)質(zhì)譜儀造成一定污染。處于對(duì)測(cè)量設(shè)備的保護(hù)，需要在進(jìn)入質(zhì)譜前盡可能去除樣品中的鈉離子，但是樣品進(jìn)行脫鹽前處理(如液-液萃取法)，將會(huì)增加實(shí)驗(yàn)步驟，給測(cè)量結(jié)果帶入一定誤差。由于本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的五種皂苷成分的保留時(shí)間均大于5 min，故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用質(zhì)譜系統(tǒng)與液相系統(tǒng)之間的三通分流泵，設(shè)定程序?qū)⑶? min的流動(dòng)相直接排入廢液管路而不進(jìn)入質(zhì)譜，通過(guò)流動(dòng)相帶走鈉離子，減少了對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)的損害的同時(shí)也不影響測(cè)定結(jié)果。

綜上，實(shí)驗(yàn)成功建立并驗(yàn)證了一套運(yùn)用LC-MS/MS整合測(cè)定血塞通注射液中的五種皂苷成分的方法，該方法靈敏度高，精密度好，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)較血塞通注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)大大縮短，為血塞通注射液的標(biāo)準(zhǔn)提高提供理論依據(jù)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為后續(xù)血塞通注射液肌肉注射后的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了優(yōu)化后的質(zhì)譜條件和五種皂苷在血塞通注射液中的含量信息。