周冠煒 羅靜 胥霞

摘? 要：針對不同產(chǎn)地的11個青稞樣品，采用已知的21種SSR引物進(jìn)行多態(tài)性分析、毛細(xì)管電泳圖譜分析和聚類分析，并構(gòu)建指紋圖譜。結(jié)果表明：17種引物的多態(tài)性良好，能很好的區(qū)分受試青稞品種;受試青稞品種遺傳相似系數(shù)在0.6206～0.9706，不同產(chǎn)地的青稞品種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一;采用3對引物就可以高效的將受試品種進(jìn)行鑒別，并構(gòu)建指紋圖譜。實(shí)驗(yàn)可以為鑒定青稞的植物基源和品種選育提供理倫依據(jù)。

關(guān)鍵詞：青稞;SSR;毛細(xì)管電泳法;指紋圖譜

中圖分類號 S512.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）13-0026-07

Abstract：A total of 21 SSR primers were used for polymorphism analysis，capillary electrophoresis mapping and cluster analysis， and fingerprints were constructed for 11 samples from different habitats.The res?Lts showed that the 17 primers had good polymorphism and co?Ld distinguish the tested c?Ltivars.The genetic similarity coefficient of the tested c?Ltivars was between 0.6206 and 0.9706.The phylogenetic relationships of different c?Ltivars were different.The three pairs of primers were used.It is possible to efficiently identify the tested varieties and construct a fingerprint.This experiment can provide reference for the identification of plant source and variety breeding of barley.

Key words：Highland barley;SSR;Capillary Electrophoresis;Fingerprint

青稞是青藏高原地區(qū)特有物種，具有悠久的栽培歷史，距今已有3500年。經(jīng)過長達(dá)1000年的馴化、雜交以及近現(xiàn)代生物技術(shù)的改良，目前青稞可分為白青稞、黑青稞、紅青稞等不同類型，多達(dá)近100個品種，分布于我國西藏、青海、四川的甘孜州和阿壩州、云南、貴州等地。近年來，隨著人們對食品安全、營養(yǎng)的重視，以青稞為主要原料、輔料的食品開始逐漸走入人們的日常飲食中。不同品種的青稞果實(shí)的營養(yǎng)成分和口感差異較大，而不同產(chǎn)地的青稞性狀表達(dá)差異較大，難以通過肉眼準(zhǔn)確鑒別。因此，有必要通過分子生物學(xué)手段對青稞親緣關(guān)系進(jìn)行鑒別。

微衛(wèi)星即簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）技術(shù)是常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，具有基因組分布廣泛、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[1]，在小麥、青稞等作物上早已有相關(guān)的研究報道[2-4]。SSR標(biāo)記研究大多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），該方法制膠難度較大、步驟多且操作繁瑣。毛細(xì)管電泳法相對于聚丙烯酰胺凝膠電泳，其優(yōu)勢在于樣品用量少、靈敏度高、分離度高和操作簡單便捷的特性;現(xiàn)已廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床，藥品和食品安全檢測等方面[5]，也可以用于蛋白質(zhì)和核酸的檢測及分子標(biāo)記中[6]。本研究根據(jù)Grain genes網(wǎng)站上已知的SSR標(biāo)記，采用多種不同引物，結(jié)合毛細(xì)管電泳法對四川、西藏、云南、青海等產(chǎn)地的幾種常見青稞品種親緣關(guān)系的鑒定進(jìn)行了初步探究，以期為青稞的植物基源和品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 已知品種的青稞材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子庫提供，其余實(shí)驗(yàn)材料由當(dāng)?shù)胤N植戶提供。各青稞產(chǎn)地信息如表1所示。

1.2 儀器、試劑

1.2.1 主要儀器 2720 thermal cycler PCR儀（Applied Biosystems公司），電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）

1.2.2 主要試劑 TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）、2x TSINGKE Master Mix、DL2000 Marker、高純度低電滲瓊脂糖、實(shí)驗(yàn)所用引物（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司），無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組提取 使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）進(jìn)行提取。具體步驟如下：（1）將核酸純化柱（Spin Column）置于Collection Tube中，加入250?L Buffer BL，12000 r/min離心1min活化硅膠膜。（2）分別稱取不同來源青稞新鮮組織100g左右，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5mL離心管中，加入400?L緩沖液gP1，渦旋振蕩1min，65℃水浴10～30min，期間可取出顛倒混勻以充分裂解。（3）加入150?L緩沖液gP2，渦旋振蕩1min，冰浴5min，然后12000 r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。（4）加入與上清等體積的無水乙醇，立即充分振蕩混勻，液體全部轉(zhuǎn)入Spin Column中，12000 r/min離心30s，棄廢液。（5）向Spin Column中加入500?L緩沖液Pw（使用前已加入無水乙醇），12000 r/min離心30s，棄廢液。（6）向Spin Column中加入500?L漂洗緩沖液（使用前已加入無水乙醇），12000 r/min離心30s，棄廢液。然后再重復(fù)加入500?L漂洗緩沖液（使用前已加入無水乙醇），12000 r/min離心30s，棄廢液。（7）將Spin Column放回Collection Tube中，12000 r/min離心2min，開蓋晾干1min。（8）取出純化柱，放入1個干凈的離心管中，在吸附膜的中央處加50～100TE緩沖液（65℃預(yù)熱TE Buffer），20～25℃放置2min，12000 r/min離心2min。

1.3.2 SSR引物選擇 根據(jù)Grain genes網(wǎng)站上已知的SSR標(biāo)記，隨機(jī)挑選均勻分布于7條青稞染色體的21對多態(tài)性較好的SSR引物，所用引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供，各引物序列見表2。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：PCR反應(yīng)總體積15?L，其中基因組DNA 1?L，2x TSINGKE Master Mix 7.5?L，10?mol/L的正向和反向引物各1?L，超純水4.5?L。擴(kuò)增程序：在2720 thermal cycler PCR儀上擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5min后，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s為1個循環(huán)，30個循環(huán)后在72℃延伸5min，在4℃下放置保存。

1.3.4 DNA完整性校驗(yàn) 采用瓊脂糖凝膠電泳對8個青稞樣品進(jìn)行基因組完整性檢測。

1.3.5 毛細(xì)管電泳 將高度去離子甲酰胺與500bp的LIZ-500內(nèi)標(biāo)按130∶1混合，配成混合物。接著用國產(chǎn)96孔反應(yīng)板進(jìn)行分裝，每個孔中加入10?L混合物。對應(yīng)在96孔板中加入0.5?L樣品模板，離心到4000后停止。上樣3730測序儀進(jìn)行毛線管電泳，結(jié)束后獲取下機(jī)結(jié)果并用軟件Genemapper 4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整性檢驗(yàn)分析 采用瓊脂糖凝膠電泳對不同產(chǎn)地11種青稞進(jìn)行基因組完整性檢測，得到如圖1和圖2的電泳圖（DL2000 DNA Marker）。由圖1和圖2可知，所有供試樣品均為單一條帶，清晰度高，完整沒有拖尾和非特異性擴(kuò)增條帶，所選取的引物擴(kuò)增出來的譜帶也非常完整，沒有雜帶，因而可以說明11個樣品中基因組完整性好，能夠進(jìn)一步做SSR標(biāo)記分析。

2.2 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析 在選取的21對引物中，有17對引物的毛細(xì)管電泳結(jié)果檢測到了多態(tài)性位點(diǎn)，占所篩選引物的80.95%。用Popgene32軟件分析得到不同引物的有效等位基因數(shù)（Na）、Shannon′s指數(shù)（Shannon′s Information Index）和多態(tài)信息含量（Polymorphismc Information Content，PIC）見表3。由表3可知，各位點(diǎn)檢測到的等位基因在2～13個，共檢測到了82個等位基因，平均每個位點(diǎn)4.82個，片段長度在143～388bp。其中，位于染色體7H上的Bmag206引物檢測到的等位基因最多，有13個，而位于染色體6H上的Bmac0040引物檢測到的等位基因最少，只有2個。有效等位基因在1.3297～8.3333，平均有效等位基因有2.8827個，Shannon′s指數(shù)在0.5481～2.3593，平均值為1.1146，其中Shannon′s指數(shù)最低的是EBmac0541標(biāo)記引物，最高的是Bmag206引物。多態(tài)信息含量能夠一定程度上反映某一引物在群體內(nèi)的檢測能力，根據(jù)Bostein等提出的對PIC值的劃分理論，高度多態(tài)性位點(diǎn)PIC值>0.5，中度多態(tài)性位點(diǎn)0.5≥PIC值≥0.25，而低度多態(tài)性位點(diǎn)PIC值<0.25[8]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，所有位點(diǎn)的PIC值在0.2389～0.8702，17個標(biāo)記當(dāng)中只有1個低度多態(tài)性位點(diǎn)，中度多態(tài)性位點(diǎn)有7個，而高度多態(tài)性位點(diǎn)有9個，占標(biāo)記總量的52.94%，充分說明所選的17個標(biāo)記引物在試驗(yàn)青稞品種中有著豐富的多態(tài)性。

2.3 毛細(xì)管電泳圖譜分析 用Genemapper 4.1軟件對毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行分析，分析每個樣品每個位點(diǎn)的等位基因擴(kuò)增片段大小，當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)≥2時，判定為不同;當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=1時，判定為近似;當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0時，判定極近似或相同[7]。其中，引物Bmag206的電泳圖譜如圖3～13所示，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，片段長度為橫坐標(biāo)。

由圖3～13的毛細(xì)管電泳圖分析可知，引物Bmag206在8個不同產(chǎn)地青稞當(dāng)中具有較多的差異位點(diǎn)，具體等位基因如圖中標(biāo)簽所示。同時，可以看到圖4、圖9、圖13都具有明顯的非特異性特征峰，可能是由于引物不適用及PCR反應(yīng)循環(huán)條件不佳[9]。圖中特異性峰的旁邊一般有大小不一的滑移峰緊密挨著，這是特異性主峰的判定依據(jù)，這些峰通常比主峰多1個（幾個）或少1個或幾個重復(fù)單位，也叫stutter峰，主要是因?yàn)槌Ｒ?guī)的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序使大的DNA片段不能得到充分的延伸，造成檢測的譜帶會出現(xiàn)幾個連續(xù)的低峰[10]。圖中還可以看到少量雜峰，但并不影響主峰的判讀，并且所有的青稞樣品圖譜都是二倍體，沒有其他多倍體出現(xiàn)。

2.4 SSR聚類分析 根據(jù)毛細(xì)管電泳最終結(jié)果，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記，有位點(diǎn)標(biāo)記為1，無標(biāo)記為0，組成由1，0構(gòu)成的矩陣，然后經(jīng)過NTSYSpc 2.1聚類分析得到如圖14的樹狀聚類圖。

通過對不同產(chǎn)地青稞材料的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到遺傳相似系數(shù)在0.6206～0.9706，遺傳距離能夠反映材料的遺傳差異情況。在遺傳相似系數(shù)為0.6206時，材料被分成了2大類，產(chǎn)地為云南昆明的Y1單獨(dú)分成了第Ⅰ大類。第Ⅱ大類劃分為2類，其中產(chǎn)地為四川阿壩的S1單獨(dú)成一類;在遺傳距離0.817附近，材料又劃分為2類，其中產(chǎn)地為青海湟中的Q1青稞單獨(dú)成一類。

從遺傳距離來看，產(chǎn)地為西藏日喀則的X1與產(chǎn)地為西藏定結(jié)的ZDM7562遺傳相似度非常高，產(chǎn)地為青海班瑪?shù)腪DM8217和產(chǎn)地為貴州丹寨的ZDM8979遺傳相似度也非常高。

通常遺傳背景相似，來源相近的品種其親緣關(guān)系也會更近[11]。但產(chǎn)地為四川阿壩的ZDM8706在遺傳距離上與同為四川產(chǎn)地的S1相去甚遠(yuǎn)，反而與產(chǎn)地為西藏的2個品種X1、ZDM7562相近;說明盡管來自相近或相同的產(chǎn)地，其品種間的差異也不一定更小，來自不同產(chǎn)地的青稞品種親緣關(guān)系也可能更近。

綜上所述，17對SSR標(biāo)記引物能很好的將11個不同產(chǎn)地青稞品種分別開來，結(jié)果表明不同來源的品種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一，4個農(nóng)家品種與已鑒定的青稞品種在種質(zhì)資源上有著不同的遺傳背景，可以作為種質(zhì)選育和品種利用的有效依據(jù)。

2.5 不同產(chǎn)地青稞指紋圖譜的構(gòu)建 根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果，以SSR標(biāo)記引物名為第1部分，以標(biāo)記在不同樣品的擴(kuò)增位點(diǎn)為第2部分，2個部分共同構(gòu)成青稞品種的編號，按照引物分析結(jié)果對其進(jìn)行排序，根據(jù)組合的代碼形成不同青稞品種的SSR指紋圖譜，見表4。

根據(jù)標(biāo)記引物和位點(diǎn)的排序結(jié)果，最終可以篩選出3對SSR引物就可以將11種不同產(chǎn)地青稞品種區(qū)別開來。僅引物Bmag206就可以區(qū)分ZDM8086、ZDM8205、ZDM8217等9個品種。而Q1則需要用引物GBS0613來進(jìn)行區(qū)分，ZDM7562則需要用引物S53707來進(jìn)行區(qū)分。僅3對引物就可以高效的將試驗(yàn)采用的農(nóng)家種與已鑒定品種進(jìn)行鑒別，為青稞品種的鑒定提供一定參考。

3 結(jié)論

SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析顯示，針對本次實(shí)驗(yàn)的8個青稞樣品，21種引物中有17種引物多態(tài)性良好，檢出等位基因數(shù)2～13個不等，共測得82個等位基因，平均每個位點(diǎn)4.82個;PIC值在0.2389～0.8702，平均PIC值為0.5178。表明青稞樣品具有豐富的遺傳多樣性，樣本間遺傳差異較大，是較為理想的實(shí)驗(yàn)對象。

毛細(xì)管電泳結(jié)果經(jīng)軟件處理后具有明顯的特征峰，盡管由于DNA片段延伸不完全造成的stutter峰和非特異性特征峰，但并不影響主峰的判讀。

聚類分析結(jié)果顯示，遺傳相似系數(shù)在0.6206～0.9706，在遺傳相似系數(shù)為0.6206時，材料被分成了2大類，產(chǎn)地為云南昆明的農(nóng)家種Y1單獨(dú)被分成了一類，其余材料歸為另一類。17對SSR引物能很好的將11個不同產(chǎn)地青稞品種分別開來，且不同產(chǎn)地的青稞品種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一，來源于不同產(chǎn)地的青稞品種也可能具有更近的親緣關(guān)系。

指紋圖譜構(gòu)建顯示，僅3對引物就可以高效的將試驗(yàn)采用的農(nóng)家種與已鑒定品種進(jìn)行鑒別。通過構(gòu)建指紋圖譜，可以為青稞的植物基源和品種選育提供參考。

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（責(zé)編：張宏民）