胡亮亮

（陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局，山東陽(yáng)信 251800）

1 IL-4的發(fā)現(xiàn)

1982年，Maureen Howard等 在研究B細(xì)胞mIg的功能時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)PMA誘導(dǎo)后的EL-4細(xì)胞系上清能夠顯著增強(qiáng)B細(xì)胞經(jīng)抗IgM抗體刺激所引發(fā)的增殖反應(yīng)，因此將上清中這種物質(zhì)稱為B細(xì)胞 生長(zhǎng)因子。隨后，該物質(zhì)對(duì)B細(xì)胞的其他功能相繼被發(fā)現(xiàn)，又被命名為B細(xì)胞刺激因子-1，1986 年，在Honjo、Lee和Arai先后克隆了鼠和人的該因子 后，國(guó)際將其統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素4，大約在同一時(shí)間，Grabstein等獲得了IL-4的氨基酸序列。Avery等在克隆雞Th2細(xì)胞因子時(shí)發(fā)現(xiàn)chIL-4，發(fā)表了mRNA序列Gallus gallus（AJ621249），由此正式拉開了chIL-4在分子水平上研究的序幕。

2 研究目的與意義

IL-4 是重要的免疫調(diào)控分子，具有多種免疫功能，了解chIL-4 在雞體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì) 于禽類傳染性疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。目前尚沒(méi)有檢測(cè)chIL-4 蛋白的 試劑盒，主要是通過(guò)各種方法檢測(cè)chIL-4 mRNA，但僅僅在mRNA 水平上進(jìn)行評(píng)估，還不能反 映出chIL-4 的實(shí)際水平。目前，雖然有檢測(cè)人和小鼠IL-4 的商品化試劑盒，但是由于chIL-4與 人和小鼠IL-4 的氨基酸同源性僅分別為22.48%和21.23%，所以人和小鼠IL-4 檢測(cè)試劑盒并不能 用于chIL-4 的檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題，本研究研制了檢測(cè)chIL-4 的雙抗體夾心ELISA，為科 學(xué)研究中chIL-4 的檢測(cè)提供方法，也為進(jìn)一步研究chIL-4 的免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3 研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線

3.1 研究?jī)?nèi)容

3.2 chIL-4 單克隆抗體的制備及鑒定

將成熟chIL-4 基因亞克隆到原核表達(dá)載體上，然后在Ecoil BL21 中誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，提 取包涵體并復(fù)性。用復(fù)性的蛋白免疫小鼠，經(jīng)過(guò)4 次免疫后，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）進(jìn)行融合，經(jīng)過(guò)3 次篩選與亞克隆后，最終得到穩(wěn)定分泌抗chIL-4 單抗的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞注入到小鼠腹腔內(nèi)，從腹水中純化出單克隆抗體，然后對(duì)抗體的亞型、親和力、特異性進(jìn)行鑒定，并分析其可能的抗原識(shí)別區(qū)。

3.3 chIL-4 雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)方法的建立

對(duì)獲得的單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記，將單抗依次作為ELISA 的捕獲抗體、與其識(shí)別不同抗原表位 的生物素化單抗則作為檢測(cè)抗體，篩選出最佳抗體對(duì)。然后通過(guò)一系列條件的優(yōu)化，建立chIL-4 雙抗體夾心ELISA，并對(duì)該檢測(cè)方法的特異性和實(shí)用性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

3.4 技術(shù)路線