樓毅云 吳曉婷 傅 萍

浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的問題之一。本研究從復(fù)發(fā)性流產(chǎn)腎虛證入手，發(fā)現(xiàn)腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者子宮蛻膜中PI3K信號(hào)通路的相關(guān)分子血清和糖皮質(zhì)激素激酶（SGK1）以及透明質(zhì)酸合成酶（HAS1、HAS2、HAS3）、透明質(zhì)酸酶（Hyal-2）透明質(zhì)酸合成酶的mRNA表達(dá)量顯著降低，提示復(fù)發(fā)性腎虛自然流產(chǎn)與子宮蛻膜中PI3K信號(hào)通路的下調(diào)相關(guān)，應(yīng)用益腎安胎中藥提高蛻膜細(xì)胞中PI3K、SGK1HAS1、HAS3、Hyal-2的表達(dá)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，以2012年6月～2016年12月期間妊娠早期（妊娠12周之前），并且依從性強(qiáng)，愿意配合隨訪的妊娠患者為研究對(duì)象，均符合相關(guān)中西醫(yī)診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。選取復(fù)發(fā)性流產(chǎn)腎虛證者30例為實(shí)驗(yàn)組，年齡20～39歲，平均28.62±2.69歲，自然流產(chǎn)次數(shù)2～4次，平均2.17±0.45次，孕周7～11周，平均8.80±2.97周。正常早期妊娠的孕婦要求人工流產(chǎn)者30例作為對(duì)照組，年齡22～34歲，平均27.00±5.08歲，自然流產(chǎn)次數(shù)0～3次，平均1.58±0.21次，孕周5～10周，平均7.41±2.44周。兩組患者年齡及孕周比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 樣本收集及處理：按照材料所述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本采集和分析，進(jìn)行分組。預(yù)先準(zhǔn)備好裝有生理鹽水的50ml離心管，將清宮術(shù)后的蛻膜組織放入生理鹽水中，冰盒內(nèi)術(shù)后30分鐘運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水沖洗蛻膜組織，吸水紙吸凈組織表面生理鹽水。凍存管分裝后放在液氮中凍存30～60min。取出，放入-80℃冰箱長期保存。

1.3 藥物制備：精密稱取菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根各200g，阿膠、當(dāng)歸、杭白芍粉各150g，碎成粗粉，混合，進(jìn)行回流提取，提取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濾過，濾液減壓回收定容至250ml，分裝滅菌，備用。每劑處方所含成分以金絲桃苷和槲皮素作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（經(jīng)LC-MS測定）。取1ml滑胎安胎協(xié)定方混合提取物（2g/ml），加入完全培養(yǎng)液，配制成濃度為30mg/ml母液，EP管分裝，每支10ml，-20℃凍存?zhèn)溆?，使用前稀釋至終濃度。

1.4 原代人蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)：無菌條件下獲得正常早期妊娠清宮術(shù)中蛻膜組織，置于含有1%雙抗的培養(yǎng)基中，在無菌條件下，用已消毒的眼科剪將蛻膜組織剪碎成糊狀，消化，過濾，置于1000rpm，離心，裂解，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以上中藥處理蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)過夜，另設(shè)空白對(duì)照組。

1.5 檢測內(nèi)容及方法：分述如下。

1.5.1 免疫組化檢測：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新鮮蛻膜組織用中性緩沖福爾馬林固定12～24小時(shí)后，梯度酒精脫水，石蠟包埋并切片。高溫高壓抗原修復(fù)后滴加PI3K一抗，37℃下孵育，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，沖洗后顯色。Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5.2 RT-PCR檢測母胎界面PI3K通路相關(guān)基因的表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛻膜組織基因組抽提后進(jìn)行總RNA濃度測定，PCR擴(kuò)增后，采用應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）測定蛻膜細(xì)胞中PI3K通路相關(guān)基因的表達(dá)水平；原代人蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)后，測定蛻膜組織中表達(dá)有差異的基因在蛻膜細(xì)胞空白組和中藥組的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K在蛻膜組織中的表達(dá)：本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組子宮蛻膜組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PI3K在早期妊娠蛻膜組織中有表達(dá)，H-score評(píng)分半定量分析（圖1）顯示實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中PI3K的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 H-score評(píng)分半定量分析早期妊娠蛻膜組織中PI3K的表達(dá)

圖2 兩組蛻膜組織中相關(guān)基因mRNA水平

2.2 PI3K信號(hào)通路上相關(guān)基因子宮蛻膜組織mRNA相對(duì)表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組子宮蛻膜組織，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-1、Hyal-2及Hyal-3的表達(dá)進(jìn)行Real time PCR分析，PI3K在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；PI3K信號(hào)通路上相關(guān)分子SGK1、HAS1和HAS3在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；HAS2在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量低于正常妊娠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Hyal-1與GAPDH相比在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）；Hyal-2在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；Hyal-3與GAPDH相比在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05)。見圖2。

2.3 益腎安胎中藥對(duì)蛻膜細(xì)胞PI3K信號(hào)通路上相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)的影響：益腎安胎中藥處理人蛻膜細(xì)胞，對(duì)中藥組和空白組蛻膜細(xì)胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表達(dá)進(jìn)行Real time PCR分析，PI3K在中藥組中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，SGK1、HAS1和Hyal-2在中藥組中的相對(duì)表達(dá)量高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；HAS3在中藥組中的相對(duì)表達(dá)量低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；HAS2在兩組中表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05)。見圖3。

圖3 益腎安胎中藥對(duì)蛻膜細(xì)胞PI3K信號(hào)通路上相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

3 討論

早期妊娠丟失，是孕期常見現(xiàn)象，據(jù)統(tǒng)計(jì)臨床妊娠中僅30%～50%的妊娠能維持至妊娠20周以上，其中約75%的妊娠丟失發(fā)生在妊娠早期，即妊娠12周前的早期流產(chǎn)[3]。自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次及以上則為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，本病不僅給患者帶來生理痛苦，可造成夫婦心理負(fù)擔(dān)[4]，甚則會(huì)影響到家庭關(guān)系的穩(wěn)定，是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的問題之一。歷代醫(yī)家多認(rèn)為本病為腎虛、脾虛、血熱、氣血虛弱、血瘀等所致。但腎為先天之本，主生殖，主藏精而系胞胎。婦人受妊，本于腎氣之旺。胎者也，本精與血之相結(jié)而成，胎孕既成，則有賴先天精氣之滋養(yǎng)及腎氣之鞏固。腎氣旺盛，臟腑協(xié)調(diào)，胞宮安和，胎者泰然蓬生，自無墮胎之虞，若腎氣匱乏，封藏失職，沖任不固，胞胎難系，即成墮胎之疾[5]。故病因雖多，眾醫(yī)家仍以腎為關(guān)鍵。因此，中醫(yī)治療以補(bǔ)腎固沖為安胎預(yù)防復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的基本之法，臨證多遣用菟絲子、桑寄生、阿膠等益腎安胎、養(yǎng)血斂精之品[6]。臨床上常適加益氣健脾之品，使先后天同補(bǔ)，氣血得生，胎元得固，而達(dá)到保胎養(yǎng)胎之目的。即使是其他因素所致胎元不固而發(fā)生的流產(chǎn)，亦常以補(bǔ)腎為大法加減化裁而取得良效。臨床報(bào)道，中藥補(bǔ)腎之法提高先兆流產(chǎn)患者血清人絨毛膜促性腺激素、孕激素、雌二醇的水平，緩解先兆流產(chǎn)的臨床癥狀，阻止其進(jìn)一步向自然流產(chǎn)的發(fā)展，從而提高先兆流產(chǎn)的治愈率[7]。

PI3K是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要細(xì)胞因子之一，在細(xì)胞的生長、增殖、代謝、遷移、分化、凋亡、血管生成、自吞噬等多種生理功能和病理過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能，PI3K及其相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子紊亂在神經(jīng)系統(tǒng)病變、自身免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等多種病變均有報(bào)道[8]?；蛐揎椀男∈竽Ｐ脱芯勘砻鳎琍I3K及其相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在卵細(xì)胞發(fā)育與激活、卵泡發(fā)育與排卵、卵細(xì)胞減數(shù)分裂的重啟與胚胎早期的發(fā)育、小鼠卵巢腫瘤以及乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[9]。研究表明PI3K相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子中的上游分子PI3K家族中class I催化亞基的p110 delta亞型（Pik3cd基因編碼）在介導(dǎo)外源性激素如雌激素（estrogen）和卵泡刺激素（FSH）影響下的卵巢顆粒細(xì)胞分泌及卵泡生長中起重要的作用，其缺失后會(huì)影響顆粒細(xì)胞的生長和增殖，進(jìn)而影響后續(xù)早期妊娠胚胎的發(fā)育與生存[10]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常妊娠對(duì)照組子宮蛻膜高表達(dá)PI3K，腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮蛻膜中PI3K以及PI3K信號(hào)通路上相關(guān)分子SGK1以及HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表達(dá)明顯下降。應(yīng)用益腎安胎中藥（菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根、阿膠、當(dāng)歸、杭白芍）處理人蛻膜細(xì)胞，PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的相對(duì)表達(dá)量增加。本研究得出結(jié)論腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者子宮蛻膜中PI3K信號(hào)通路上相關(guān)分子PI3K以及SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的mRNA表達(dá)量顯著降低，并且HAS1、HAS2、HAS3的蛋白表達(dá)較正常妊娠組減少，腎虛自然流產(chǎn)與子宮蛻膜中PI3K信號(hào)通路的下調(diào)相關(guān)。益腎安胎中藥提高蛻膜細(xì)胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的表達(dá)，益腎安胎中藥可通過調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)通路從而改善妊娠結(jié)局。

本研究通過研究腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和正常妊娠孕婦母胎界面PI3K信號(hào)通路上相關(guān)分子的表達(dá)，分析母胎界面PI3K及其信號(hào)通路上相關(guān)分子的表達(dá)與腎虛型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的聯(lián)系；通過研究益腎安胎中藥對(duì)蛻膜細(xì)胞PI3K及其信號(hào)通路上相關(guān)分子表達(dá)改變的影響，進(jìn)一步闡述母胎界面PI3K及其信號(hào)通路上相關(guān)分子的表達(dá)影響妊娠結(jié)局的機(jī)理，為中醫(yī)藥補(bǔ)腎治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥防治的研究提供新的思路和途徑。