楚遵鋒

（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 250022）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康的傳染病，根據(jù)致病力可分為高致病力和低致病力，其中高致病性禽流感是危害禽類養(yǎng)殖的重要疫病之一，OIE 列為必須報(bào)告的疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病，主要是H5亞型禽流感和部分H7亞型禽流感，目前，我國(guó)主要采用強(qiáng)制免疫的策略結(jié)合生物安全措施進(jìn)行綜合防控，而H9亞型禽流感因其致病力較弱，列為低致病力禽流感。

1 材料

1.1 樣品

從山東省某一肉雞場(chǎng)，采集病死雞的氣管、肺臟樣品4 份。

1.2 試劑

病毒核酸提取試劑盒，由蘇州天隆生物科技有限公司提供；禽流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，凱杰生物工程（深圳）有限公司提供；雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，北京生科尚儀科技有限公司提供；新城疫病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒；流感病毒H9亞型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、流感病毒H7亞型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、流感病毒H5亞型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒由江蘇碩世生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

NP968 天隆核酸提取儀，Roche Lightcycler 480 熒光定量PCR 儀。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

取病死雞的氣管、腎臟樣品，研磨，用pH7.2 PBS 液配制成體積比 1:5 的混懸液，凍融 3 次，8000rpm 離心 5min，取上清備用。

1.4.2 核酸提取

將處理好的組織混懸液上清取200μL，加入核酸提取試劑盒的第一列，并加入20μL 蛋白酶K 孵育，用核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，最后溶解核酸100μL，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 病原定性檢測(cè)

用通用型禽流感病毒熒光PCR、新城疫病毒熒光PCR 以及傳染性支氣管炎病毒熒光PCR 進(jìn)行病原檢測(cè)：取0.1mL PCR八連管，每一個(gè)管中加入 15μL RT-PCR 反應(yīng)液，0.25μL RTPCR 酶，0.25μL Taq 酶，然后加入 10μL 病毒核酸，同時(shí)作陰性、陽(yáng)性對(duì)照。將加好反應(yīng)液的PCR 管放入熒光定量PCR 儀中，進(jìn)行反應(yīng)：42℃30min，92℃3min，5 個(gè)循環(huán)：92℃10sec，45℃30sec，72℃1min，40 個(gè)循環(huán)：92℃10sec，60℃30sec。最后一步收集熒光，熒光信號(hào)收集設(shè)定為Fam 熒光素。

2.1.2 禽流感病原定型檢測(cè)

流感病毒H9亞型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、流感病毒H7亞型熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定型檢測(cè)：采用取0.1ml PCR 八連管，每一個(gè)管中加入 7.5μL RT-PCR 反應(yīng)液，5μL RT-PCR 酶，流感病毒分型反應(yīng)液 4μL，去 RNA 酶水 3.5μL，然后加入 5μL 病毒核酸，同時(shí)作陰性、陽(yáng)性對(duì)照。將加好反應(yīng)液的PCR 管放入熒光定量 PCR 儀中，進(jìn)行反應(yīng)：50℃30min，95℃5min，45 個(gè)循環(huán)：95℃10sec，55℃40sec。最后一步收集熒光，熒光信號(hào)收集設(shè)定為Fam 熒光素。

2.2 結(jié)果

2.2.1 病原定性檢測(cè)

通過(guò)熒光RT-PCR 檢測(cè)，送檢的4 份樣品，雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒均沒有cp 值，判定為陰性，4 份樣品禽流感病毒 cp 值在 10.10～11.37，判定為陽(yáng)性，見表1、圖1。

2.2.2 禽流感病原定型檢測(cè)

通過(guò)流感病毒H9亞型核酸檢測(cè)試劑盒、流感病毒H7亞型核酸檢測(cè)試劑盒、流感病毒H5亞型核酸檢測(cè)試劑盒、進(jìn)行分型檢測(cè)，H5、H7亞型流感檢測(cè)結(jié)果均為陰性，H9亞型流感病毒核酸檢測(cè) cp 值 20.187～25.561 判定為陽(yáng)性，見表2、圖2。

圖1 禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎病原檢測(cè)

圖2 H5、H7、H9 亞型禽流感病毒分型檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查分析、剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診引起該養(yǎng)禽場(chǎng)發(fā)病的主要病因?yàn)镠9亞型流感病毒。H9亞型流感病毒雖然對(duì)禽類的致病率較低，但可以引起產(chǎn)蛋減少，造成免疫抑制，在普遍存在感染的情況下，可以造成復(fù)合感染，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)嚴(yán)重，而且低致病力禽流感引起養(yǎng)殖戶的重視程度遠(yuǎn)不如高致病性禽流感，對(duì)于防疫、生物安全措施的應(yīng)對(duì)措施也相對(duì)較差，一旦在禽群中存在，將會(huì)造成嚴(yán)重的損失。

表1 病原定性檢測(cè)結(jié)果

表2 禽流感病毒核酸定型檢測(cè)