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(1．山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點實驗室，濟南 250100；2．青島新光智源環(huán)境科技有限公司，青島 266011；3．山東省計量科學(xué)研究院，濟南 250014；4.山東大學(xué)，濟南 250014；5.中國測試技術(shù)研究院，成都 610212)

黃曲霉，常出現(xiàn)在發(fā)霉糧食、糧制品及其它霉腐有機物上的一種腐生真菌[1]，其代謝產(chǎn)生的黃曲霉毒素具有強烈的毒性以及致癌、致畸、致突變性[2，3]。黃曲霉毒素的毒性相當于氰化鉀的 10 倍，砒霜的 68 倍，二甲基亞硝胺的70倍，并且已經(jīng)被國際癌癥研究組織確定為I類致癌物[4，5]。黃曲霉毒素現(xiàn)已被分離鑒定出20多種，其中常見的有B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1)、M2(AFM2)6種[6]，而在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強[7]。鑒于黃曲霉毒素的嚴重危害，為杜絕食品安全問題，保護人體健康，我國對黃曲霉毒素有嚴格的檢出標準。《GB2761-2011》要求對玉米、玉米面、玉米制品、花生、花生制品及花生油中的黃曲霉毒素含量不高于20μg/kg；稻米、糙米、大米及植物油類(花生油除外)中不高于10μg/kg；小麥與大豆及其制品、熟制堅果、醬油等調(diào)味品中不高于5μg/kg；嬰幼兒配方食品要求更為嚴格，毒素含量必須低于0.5μg/kg。

目前，檢測黃曲霉毒素的方法主要有色譜法、酶聯(lián)免疫法和色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]?，F(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的是液相色譜法，由于B1和G1遇水發(fā)生熒光猝滅，因此需要進行衍生來提高其靈敏度[11]。柱后光衍生是最常見的一種衍生方法，相對于柱前衍生和柱后碘衍生，柱后光衍生具有使用方便、準確、無任何毒害作用、對儀器損傷小等特點[12]。因此，柱后衍生已經(jīng)成為近年來實驗室檢測黃曲霉毒素的主流方法。新光智源環(huán)境科技有限公司研發(fā)的AIC80黃曲霉毒素專用儀，其配備的熒光檢測器即內(nèi)置有光化學(xué)衍生系統(tǒng)，其使用壽命高達20000小時，是常規(guī)進口設(shè)備的7倍[13]。系統(tǒng)中檢測器配用小功率LED光作為激發(fā)光源，其功率小，使用壽命在15000～20000小時左右，相比傳統(tǒng)的氙燈長5～6倍；自制的AccuOpt光電放大組件作為為接收器件，相比光電倍增管，具有抗電磁干擾，強光免疫，啟動時間快的特點；其流通池體積0.1 mL，相比進口的1 mL衍生池，能夠大大降低峰展寬，提高靈敏度?；诖丝钚麻_發(fā)的國產(chǎn)黃曲霉毒素專用測試儀，本文研發(fā)出一種快速檢測面粉、飼料、奶粉、蓮子等食品中黃曲霉毒素B1含量的有效檢測方法，該方法簡單易操作、靈敏度和準確度高，可為科研院所、檢測機構(gòu)或生產(chǎn)企業(yè)等單位提供精準測量黃曲霉毒素提供參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器

AIC80黃曲霉專用儀(新光智源環(huán)境科技有限公司)，配有LED光源的熒光檢測器和光衍生器；SB-5200D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；漩渦振蕩器(Vortex-Genie-2 上海思博明有限公司)；純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；氮吹儀(DN-12A-DC 天津東康科技有限公司)；高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)；電子天平(AL104，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.1.2試劑

乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲醇(色譜純，德國默克公司)；226多功能凈化柱(上海Romer有限公司)；免疫親和柱(上海Romer公司)；黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準品(2.6μg/mL ，Aflatoxin Total solution in Acetonitrile，上海Romer公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP(4.6×150mm，5μum)；柱溫：45℃；進樣量：25μL；檢測波長為：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm；流動相：甲醇∶水=45∶55；流速1mL/min

1.3 前處理過程

1.3.1免疫親和柱法

(1)提?。喝?g樣品(飼料、藥品等樣品需粉碎)于50mL離心管中，加20mL甲醇-水(體積分數(shù)6∶4)，放置超聲波中超聲20min，6000r離心7min，取離心后上清備用。

(2)凈化：取上述樣液5mL移至50mL加水或緩沖鹽溶液定容，上樣過柱，控制過柱速度，使液體緩慢穩(wěn)定下滴；待樣液滴完后，再加入10mL水淋洗，棄去淋洗液，抽干親和柱。加入2mL甲醇洗脫親和柱，收集全部洗脫液至試管中。

(3)濃縮：在50℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，用初始流動相定容至1. 0mL，渦旋30s溶解殘留物，0. 22μm濾膜過濾，待上機。

1.3.2226多功能凈化柱法

(1)提?。悍Q取5g樣品(飼料、蓮子等固體樣品粉碎至粒徑1mm以下)放于50mL離心管中，加入20mL乙腈提取液混勻。10000r/min以上高速均質(zhì)1min，超聲提取30min，7500r/min離心機離心20min后收集上清液。

(2)凈化：將5mL樣品提取液注入試管中，再將凈化柱放入試管中并下壓提取液，上滲的樣品即為凈化后樣品，可將其轉(zhuǎn)移紙EP管中。

(3)濃縮：取2mL凈化提取液，氮吹至干，用1mL初始流動相復(fù)溶，過微孔濾膜，上機分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法比較

食品中檢測黃曲霉毒素的前處理凈化一般采用用免疫親和柱或多功能凈化柱[14,15]。本實驗選用這兩種前處理小柱進行同一種樣品的檢測比較，結(jié)果如圖1所示。由M和N譜圖可以看到該蓮子經(jīng)過兩種小柱處理的樣品都未檢測出黃曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)，說明實驗中所處理的蓮子較為新鮮，還沒有發(fā)生自然霉變，無黃曲霉菌的生長；m、n譜圖是前處理后樣品液加標相同含量B1毒素(2μg/kg)后所測，可以看到226凈化柱處理的樣品中毒素B1響應(yīng)值(5.811mV)高于免疫親和柱所處理樣品中的B1響應(yīng)值(4225mV)，表明前者對樣品中雜質(zhì)具有較好的清除作用，從而減小檢測器對相應(yīng)的黃曲霉毒素的影響程度，得到更好的檢測效果。圖1中各譜圖停留時間在5 min之前的峰均為樣品雜質(zhì)峰，226凈化柱處理的樣品譜圖N、n相比免疫親和柱所處理樣品譜圖M、m，雜質(zhì)峰種類少且含量(響應(yīng)值)明顯低，說明了226凈化柱較好的除雜效果，與前面的結(jié)論相契合。

圖1 不同前處理方法下的蓮子樣品實測和加標譜圖M，m分別代表免疫親和柱處理的真實樣品和加標2μg/kg B1的譜圖；N，n分別代表226凈化柱處理的真實樣品和加標2μg/kg B1的譜圖

2.2 樣品衍生和非衍生對比

食品中檢測黃曲霉毒素的前處理凈化一般采用用免疫親和柱或多功能凈化柱。本實驗選用這兩種前處理小柱進行同一種樣品的檢測比較，結(jié)果如圖1所示。由M和N譜圖可以看到該蓮子經(jīng)過兩種小柱處理的樣品都未檢測出黃曲霉毒素(G2、G1、B2、B1)，說明實驗中所處理的蓮子較為新鮮，還沒有發(fā)生自然霉變，無黃曲霉菌的生長；m、n譜圖是前處理后樣品液加標相同含量B1毒素(2μg/kg)后所測，可以看到226凈化柱處理的樣品中毒素B1響應(yīng)值(5.811mV)高于免疫親和柱所處理樣品中的B1響應(yīng)值(4225mV)，表明前者對樣品中雜質(zhì)具有較好的清除作用，從而減小檢測器對相應(yīng)的黃曲霉毒素的影響程度，得到更好的檢測效果。圖1中各譜圖停留時間在5 min之前的峰均為樣品雜質(zhì)峰，226凈化柱處理的樣品譜圖N、n相比免疫親和柱所處理樣品譜圖M、m，雜質(zhì)峰種類少且含量(響應(yīng)值)明顯低，說明了226凈化柱較好的除雜效果，與前面的結(jié)論相契合。

前述2.1中所示檢測譜圖皆為黃曲霉毒素化學(xué)衍生后的檢測結(jié)果，而對于不進行化學(xué)衍生，該儀器與方法是否還仍有效果也進行了考量。M和m即為飼料樣品226凈化柱處理的有衍生和無衍生后的樣品檢測譜圖?？梢钥吹?，是否衍生對黃曲霉毒素G2、B2的檢測效果無明顯影響，因為二者有相似的響應(yīng)值。而對于毒素G1和B1，經(jīng)過衍生后的樣品相應(yīng)響應(yīng)值明顯居高，檢測靈敏度優(yōu)異；未經(jīng)衍生的樣品毒素B1雖然響應(yīng)值偏低，但峰型明顯，也能實現(xiàn)較為有效的定性和定量。因為在黃曲霉毒素眾多的組分中B1毒性最強[7]，B1值的大小可代表食品中黃曲霉毒性的強弱，所以，非衍生操作也有其一定的可行性(圖2)。

圖2 凈化柱前處理下的飼料樣品衍生(M)和非衍生(N)譜圖

2.3 線性及檢出限

由于B1是黃曲霉毒素中的典型成分，本實驗配制了一系列梯度濃度的B1標液，通過柱后衍生測得結(jié)果如表1所示。以峰面積Y為縱坐標，濃度X為橫坐標，制得標準線性曲線如圖3所示。在B1濃度范圍0.01～20μg/kg內(nèi)，線性方程Y= 45340X- 7780，相關(guān)系數(shù)r為0.999873，說明該方法線性良好，儀器檢測狀態(tài)優(yōu)良。

表1 黃曲霉毒素B1系列標準樣品濃度及響應(yīng)值

選擇空白樣品(高純?nèi)ルx子水)，定量添加黃曲霉毒素B1，測得儀器的最低B1檢出濃度為0.1μg/kg，根據(jù)其相應(yīng)的響應(yīng)值(0.221 mV)，在信噪比為3，噪聲0.05 mV的基礎(chǔ)上計算得到檢出限為0.007 μg/kg，遠遠優(yōu)于國標GB5009.22-2016中的0.03μg/kg。

圖3 黃曲霉毒素成分B1標準曲線

2.4 定量重復(fù)性驗證

為檢測儀器的穩(wěn)定性，配制5μg/kg的黃曲霉毒素B1標樣，連續(xù)進樣7針，得到的檢測結(jié)果如表2所示，其相對標準偏差為0.69%，遠遠小于國家標準的2.5%，說明該儀器在現(xiàn)有的檢測條件下具有優(yōu)異的檢測重復(fù)性，精密度良好。

2.5 加標回收率

對4種實際樣品(蓮子、飼料、酸棗仁、遠志中藥)按照226多功能凈化柱前處理步驟進行凈化后檢測，4種樣品中都未檢測出黃曲霉毒素。加標2 μg B1，得到的具體檢測結(jié)果如表3所示?？梢钥吹剑糠N樣品的加標回收率都在80%～90%之間，方法準確度良好。

表2 5 μg/kg黃曲霉毒素B1連續(xù)進樣測試結(jié)果

表3 樣品中黃曲霉毒素B1加標測試結(jié)果

3 結(jié)論

基于新光智源環(huán)境科技有限公司研發(fā)的AIC80黃曲霉毒素專用儀，建立了一套快速檢測面粉、奶粉、飼料、中藥等食物中黃曲霉毒素的方法。該方法使用的226多功能凈化柱對樣品基質(zhì)清除效果優(yōu)異，柱后光化學(xué)衍生技術(shù)下的黃曲霉毒素檢測靈敏度高。黃曲霉毒素B1在0.01～20μg/kg內(nèi)線性關(guān)系良好，同一樣品重復(fù)性檢測值的相對標準偏差為0.69%，不同樣品的加標回收率在80%～90%之間，儀器定量重復(fù)性好，符合相應(yīng)國標要求。