牛四坤
(山西藥科職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,山西太原030031)
金耳,學(xué)名金木耳(Tremella aurantialba),屬于擔(dān)子菌綱銀耳屬,是一種珍貴的藥用和食用菌類。野生金耳非常稀有,金耳種植會(huì)受到季節(jié)、場地的影響,且金耳種植產(chǎn)品質(zhì)量不夠穩(wěn)定,所以目前金耳的液體發(fā)酵成為一種有前景的金耳菌生產(chǎn)方式,菌絲體液體發(fā)酵不受季節(jié)限制,節(jié)約場地,金耳菌絲體質(zhì)量穩(wěn)定性好,生產(chǎn)效率高,其菌絲體營養(yǎng)成分與子實(shí)體基本相同[1]。近年來,藥理學(xué)研究表明,金耳具有抗上呼吸道感染、抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、消炎解毒、抗凝血抗血栓的作用[2-3]。前期研究表明,金耳抗凝血的活性成分主要為香豆素類化合物,并以香豆素含量為評價(jià)指標(biāo)對其提取工藝進(jìn)行了研究,但該工藝能耗高、時(shí)間長、操作繁瑣、香豆素類成分易被破壞。
本研究基于超聲波提取技術(shù)具有快速簡便、價(jià)廉、高效、不易破壞天然活性成分等優(yōu)點(diǎn)[4-5],以超聲輔助提取法對金耳香豆素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究,以期為今后金耳菌絲體作為保健食品或藥品提供成分分析研究基礎(chǔ)。
1.1.1 材料 供試金耳菌絲體由山西省生物研究所金耳9800 菌種發(fā)酵制得,批號(hào)(20170511)。
1.1.2 試劑及儀器 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品(由中國藥品生物制品檢定所提供);甲醇(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司);無水乙醇(AR)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);紫外-可見分光光度計(jì)(SHIMADZU UV-1601PC);超聲波清洗器KS-120D(寧波海曙科聲超聲設(shè)備有限公司)。
1.2.1 金耳菌絲體總香豆素提取工藝[6]金耳菌絲體(濕)→清洗→烘干→粉碎→稱取適量金耳菌絲體(干)→超聲波醇提取→減壓過濾→去除濾渣→取濾液。
1.2.2 金耳香豆素測定[7-8]
1.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品6.3 mg 于25 mL 容量瓶中,加甲醇溶解定容至刻度,再精密吸取1 mL 至容量瓶中,甲醇定容至50 mL,制得對照品溶液。
1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]分別精密量取補(bǔ)骨脂素對照品溶液1,3,5,7,10 mL 置各容量瓶中,用甲醇定容至10 mL。以甲醇為空白對照,在245 nm 處測定吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、補(bǔ)骨脂素濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=0.007 6+0.112 1C(r=0.999 7,n=5)。試驗(yàn)表明,補(bǔ)骨脂素對照品濃度在0.504 0~5.040 0 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度成線性關(guān)系。
1.2.2.3 樣品香豆素測定 精密量取超聲輔助提取液1 mL 置于100 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算金耳總香豆素濃度及提取率。
1.2.2.4 金耳總香豆素提取率計(jì)算 總香豆素提取率=樣品提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量×100%。
1.2.3 金耳菌絲體香豆素提取工藝的優(yōu)化 選取液料比、超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇濃度4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),根據(jù)4 個(gè)因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍,以總香豆素提取率作為優(yōu)化指標(biāo),采用正交試驗(yàn)對金耳香豆素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.1.1 乙醇濃度對金耳香豆素提取率的影響[11]準(zhǔn)確稱取金耳菌絲體干粉5 g,分別用30%,40%,50%,60%,70%和80%的乙醇對金耳菌絲體香豆素進(jìn)行超聲提取,考察乙醇濃度對提取率的影響情況。從圖1 可以看出,隨乙醇濃度的增加,金耳香豆素提取率先上升后下降,當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí),金耳香豆素提取率達(dá)0.76%,為最高,這是由于50%乙醇的極性與金耳香豆素極性相近,因此,根據(jù)相似相溶原理,50%的乙醇對金耳香豆素的提取效果較好。
2.1.2 液料比對金耳香豆素提取率的影響[12]準(zhǔn)確稱取金耳菌絲體干粉5 g,分別用5∶1,10∶1,15∶1,20∶1,25∶1 和30∶1(mL/g)的液料比對金耳香豆素進(jìn)行提取,觀察金耳香豆素的提取率。由圖2 可知,在液料比為5∶1~20∶1(mL/g)范圍內(nèi),隨著乙醇用量的增大,金耳香豆素提取率也逐漸升高,當(dāng)液料比大于20∶1時(shí),提取率變化不大,這是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑用量大到一定程度后,會(huì)增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力,一定程度上降低了金耳香豆素的提取率[11],此時(shí)滲透壓的改變不足以提高香豆素的提取率,同時(shí)考慮到成本及試劑回收的難度,選取20∶1為最佳液料比,此時(shí)金耳香豆素提取率最大,為0.74%。
2.1.3 超聲波功率對金耳香豆素提取率的影響[13]準(zhǔn)確稱取金耳菌絲體干粉5 g,分別采取100,150,200,250,300,350 W 的超聲波功率對金耳香豆素進(jìn)行提取,考察超聲功率對金耳香豆素提取率的影響。從圖3 可以看出,超聲功率為100~200 W 時(shí),隨著功率的增大,金耳香豆素的提取率也增加;當(dāng)超聲功率在200~350 W 時(shí),金耳香豆素提取率隨著超聲功率的增大而逐漸降低。另外,考慮到隨著超聲功率的增大,金耳菌絲體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出增多,增加了后期提取液中香豆素類化合物的純化難度,確定較適宜的超聲功率為200 W,此時(shí)金耳香豆素提取率為0.71%,提取率較高。
2.1.4 超聲波提取時(shí)間對金耳香豆素提取率的影響[14]準(zhǔn)確稱取金耳菌絲體干粉5 g,分別采用20,30,40,50,60,70 min 的超聲波提取時(shí)間對金耳菌絲體進(jìn)行處理,以考察超聲波提取時(shí)間與香豆素提取率的關(guān)系。從圖4 可以看出,金耳香豆素提取率隨著提取時(shí)間的延長在不斷提高,隨著提取液中香豆素含量的增加,再加上金耳菌絲體中香豆素的量逐漸減少,從而使得提取液中金耳香豆素含量增長減緩。當(dāng)提取時(shí)間超過50 min 后,金耳香豆素提取率變化不大,為0.70%??紤]到時(shí)間成本及香豆素類化合物的破壞因素,提取時(shí)間50 min 較為適宜。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,分別選取液料比15∶1,20∶1,25∶1(mL/g),超聲波功率150,200,250 W,乙醇濃度40%,50%和60%,超聲波提取時(shí)間40,50,60 min,利用正交試驗(yàn)對金耳香豆素的超聲醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)列于表1,正交試驗(yàn)結(jié)果列于表2。
表1 因素水平
表2 正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
從表2 可以看出,提取金耳香豆素的各因素主次順序?yàn)锳>B>D>C,即乙醇濃度>液料比>超聲功率>超聲時(shí)間。金耳香豆素的提取工藝條件最優(yōu)組合為A2B3C1D2,即乙醇濃度為50%,液料比為25∶1,超聲波提取時(shí)間為40 min,超聲波功率為200 W,在此條件下,金耳香豆素的提取率達(dá)到0.85%。將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,其結(jié)果列于表3。從表3 可以看出,乙醇濃度對金耳香豆素提取率影響顯著,其他3 個(gè)因素液料比、超聲時(shí)間、超聲功率對金耳香豆素提取率影響不顯著。
考慮到溶劑毒性、成本及乙醇良好提取特性,選擇乙醇作為為提取溶劑[17-18],采用超聲輔助提取,本研究通過單因素試驗(yàn)考察各提取因素對金耳香豆素的影響,利用正交試驗(yàn)對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,得出了金耳菌絲體總香豆素最佳提取工藝條件:采取50%乙醇、液料比25∶1、超聲提取時(shí)間40 min、超聲功率200 W,在此條件下,金耳菌絲體總香豆素的提取率達(dá)到0.85%。與傳統(tǒng)醇提取法相比,超聲波輔助提取耗時(shí)短、能耗低、提取率高且不易破壞提取物活性[19-20],因此,其可用于金耳菌絲體香豆素的提取。該結(jié)果可為今后金耳菌絲體化學(xué)成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。