雷 慧，李 鴿，王娜玉

（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000）

金蓮花（Trollius chinensis Bunge）又名寒金蓮、旱地蓮，為毛茛科金蓮花屬植物，喜冷涼濕潤(rùn)環(huán)境，在內(nèi)蒙古、河北、山西等省區(qū)海拔1 800 m 以上的高山草甸或疏林地帶常有分布[1]。金蓮花為五臺(tái)山特色植物之一，不僅觀賞價(jià)值高，也具有良好的藥用價(jià)值，具有清熱解毒功效，可用于治療扁桃體炎、上呼吸道感染、急性中耳炎和咽炎等[2]。

葉綠體是光合作用的重要細(xì)胞器，在生物合成淀粉、脂肪酸等方面扮演著重要角色，且通過(guò)母系遺傳有自主的遺傳體系，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。截至2018 年12 月19 日，NCBI 網(wǎng)站上已公布葉綠體基因組2 356 個(gè)，包括植物、藍(lán)藻和真菌等，其中，以經(jīng)濟(jì)作物、農(nóng)作物和藥用植物的葉綠體基因組為主要研究對(duì)象[3]。以葉綠體為代表的質(zhì)體基因工程研究已取得了一系列重要進(jìn)展。人們已成功應(yīng)用葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化手段將抗菌、綜合抗性、編碼滲透保護(hù)劑等相關(guān)基因?qū)霟煵葜?，可提高其抗真菌、病原體、昆蟲(chóng)的能力和增加耐鹽、耐旱等非生物壓力[4-6]。

密碼子在生物體遺傳信息的傳遞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，由不同的密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子稱為同義密碼子[7]。同義密碼子的使用在蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程中并不是隨機(jī)選擇的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，密碼子的使用存在著不均等現(xiàn)象，即使是同一物種，其不同蛋白質(zhì)中相同氨基酸對(duì)密碼子的選用頻率也不同，即密碼子的使用具有偏好性，使用頻率高的密碼子為高頻優(yōu)越密碼子[8]。吳彥慶等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同植物中的花分生組織決定基因APETALAI的密碼子使用模式存在一定差異，進(jìn)化關(guān)系較密切的物種具有顯著的相似密碼子使用模式，但每個(gè)物種都有自己的最優(yōu)密碼子，通過(guò)對(duì)密碼子使用模式的研究確定物種最優(yōu)密碼子，為葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化手段提供便利，并進(jìn)一步提高外源基因的表達(dá)。

目前，五臺(tái)山野生金蓮花數(shù)量銳減，但對(duì)其研究多局限于化學(xué)成分如黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、生物堿和萜類(lèi)等化合物的分離提取上。為促進(jìn)藥用植物種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用，前期研究已對(duì)金蓮花葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝和注釋?zhuān)⒃贕enBank注冊(cè)（序列號(hào)為KX752098）。已在很多植物如蝴蝶蘭[10]、蒺藜苜蓿[11]、苦蕎[12]以及包括杉木在內(nèi)的5 種針葉樹(shù)[13]進(jìn)行過(guò)葉綠體基因組的密碼子分析。

本研究通過(guò)對(duì)金蓮花葉綠體密碼子使用模式及基因表達(dá)和轉(zhuǎn)基因研究的異源受體進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究金蓮花分子系統(tǒng)進(jìn)化、提高外源基因表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從GenBank 中獲取山西五臺(tái)山野生金蓮花葉綠體基因組序列（編號(hào)為KX752098），全長(zhǎng)160 191 bp，共有85 條蛋白質(zhì)編碼基因。為了減少誤差，準(zhǔn)確地計(jì)算出有效密碼子數(shù)，研究時(shí)選取長(zhǎng)度大于300 bp、以AUG 為起始密碼子和中間無(wú)終止密碼子的49 條序列作為各項(xiàng)數(shù)據(jù)研究的對(duì)象[14]。

1.2 試驗(yàn)方法

分析時(shí)去除不存在偏好性的密碼子，如色氨酸的唯一密碼子UGG；蛋氨酸的唯一密碼子AUG；終止密碼子UAA、UGA、UAG。使用Codon W 軟件對(duì)49 條編碼蛋白質(zhì)的DNA 序列進(jìn)行密碼子的使用特性參數(shù)進(jìn)行3 次重復(fù)分析，再用Excel、SPSS 軟件分析這些參數(shù)間的相關(guān)性[15]。最優(yōu)密碼子的確定是以49 個(gè)基因的有效密碼子數(shù)值（Effective Number of Codon，ENC）大小為標(biāo)準(zhǔn)，兩邊各選10%的基因建立高低表達(dá)基因偏性庫(kù)，選取兩庫(kù)相對(duì)同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU）差值大于0.08 且在高表達(dá)基因庫(kù)中RSCU 值大于1 的密碼子[16]。從數(shù)據(jù)庫(kù)Codon Usage Database（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）中搜索擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichia coli）基因組密碼子的選用偏好性數(shù)據(jù)，再與金蓮花的葉綠體基因組密碼子使用偏好性進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 金蓮花葉綠體基因組密碼子使用特性分析

用Codon W 軟件對(duì)金蓮花葉綠體編碼蛋白序列分析，結(jié)果顯示（表1），基因編碼區(qū)GC 含量在30.70%～46.60%內(nèi)波動(dòng)，平均值為38.73%；同義密碼子第3 位堿基出現(xiàn)U 和A 頻率的平均值較大，分別為45.61%和42.01%；第3 位堿基出現(xiàn)G 和C 頻率的平均值較小，分別為17.50%和18.11%；第3 位密碼子的GC 含量（GC3s）平均值為27.60%。這些堿基組成偏好性表明，金蓮花葉綠體蛋白編碼序列密碼子中AU 的使用頻率高于GC，密碼子第3 位上的偏好性表明，大部分密碼子以A/U 結(jié)尾。

有效密碼子數(shù)（ENC）的大小可量化一個(gè)基因的密碼子使用頻率與同義密碼子平均使用頻率的偏差，從而檢測(cè)單個(gè)基因密碼子的偏好程度，若每個(gè)氨基酸只使用一個(gè)密碼子，此基因的ENC 值為20；反之，除3 個(gè)終止密碼子不編碼任何蛋白外，每個(gè)密碼子都被均衡使用，則ENC 值為61。一個(gè)基因的ENC 值越小，密碼子使用偏好程度越大，對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量往往也越高，可以通過(guò)ENC 值判斷基因表達(dá)量的高低。當(dāng)ENC 值大于35 時(shí)，一般認(rèn)為表達(dá)水平較低，在編碼氨基酸時(shí)，對(duì)密碼子的選用偏好性也較弱[17]。金蓮花葉綠體的ENC 值在40.21～55.54 波動(dòng)，平均值為48.30，說(shuō)明金蓮花葉綠體基因密碼子的偏好性較弱。

金蓮花葉綠體基因密碼子部分使用參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明（表2），有效密碼子數(shù)ENC 與U3s、A3s 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與G3s、GC3s呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明同義密碼子第3 位上的堿基含量直接影響密碼子使用偏好程度和基因的表達(dá)水平。密碼子使用偏好性越強(qiáng)的基因，ENC 值越小，越偏好使用U/A 結(jié)尾的密碼子，這與第3 位密碼子富含A 和U 相一致。

RSCU 表示一個(gè)密碼子的實(shí)際使用頻率與無(wú)偏好性時(shí)理論使用頻率之間的比值[18]。若一個(gè)密碼子的RSCU 值為1，表示其使用沒(méi)有偏好性；若大于1，則表示該密碼子的使用較頻繁，反之亦然[19]。金蓮花葉綠體基因組18 種氨基酸59 個(gè)密碼子的RSCU 數(shù)值分析結(jié)果列于表3，RSCU 值小于1 的密碼子，多以C 或G 結(jié)尾，每種氨基酸的最高頻優(yōu)越密碼子RSCU 值均大于1，且以A 或U 結(jié)尾，即金蓮花葉綠體密碼子第3 位A/U 比C/G 的偏好性強(qiáng)，同義密碼子第3 位的堿基含量對(duì)基因表達(dá)程度和密碼子使用偏好性范圍起到一定的作用。

表1 金蓮花葉綠體各基因密碼子組成和使用參數(shù)

表2 金蓮花葉綠體基因密碼子使用參數(shù)的相關(guān)性分析

表3 金蓮花各氨基酸相對(duì)同義密碼子使用度

續(xù)表3

2.2 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)金蓮花葉綠體49 條基因的ENC 大小進(jìn)行排序，從排好的兩側(cè)各取基因總數(shù)的10%即5 條基因，組成高低表達(dá)偏好性樣本庫(kù)，若在兩庫(kù)中RSCU的差值即ΔRSCU≥0.08，則相對(duì)應(yīng)的密碼子為高表達(dá)優(yōu)越密碼子[16]，再結(jié)合高表達(dá)基因庫(kù)中RSCU＞1即高頻優(yōu)越的密碼子為最優(yōu)密碼子。最終得到表4中*標(biāo)記的UUU 編碼苯丙氨酸（Phe）、UAU 酪氨酸（Tyr）、UUA 亮氨酸（Leu）、AGA 精氨酸（Arg）、AAU天冬酰胺（Asn）、UCA 絲氨酸（Ser）、CAU 組氨酸（His）、ACA 蘇氨酸（Thr）、GGA 甘氨酸（Gly）共9 個(gè)最優(yōu)密碼子。

表4 金蓮花葉綠體最優(yōu)密碼子的確定

2.3 金蓮花與其他生物的密碼子偏好性比較

密碼子使用頻率比值是衡量不同物種間密碼子使用偏性差異的指標(biāo)，若2 個(gè)物種間比值大于0.50 小于2.00，說(shuō)明密碼子使用特性較一致；否則差異較大[20]。根據(jù)表3 統(tǒng)計(jì)的金蓮花葉綠體各密碼子選用頻率分別與Codon Usage Database 中大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、水稻密碼子使用頻率進(jìn)行比較，結(jié)果表明（表5），金蓮花與大腸桿菌使用偏好性差異較大的密碼子有24 個(gè)，與酵母菌差異較大的密碼子僅有6 個(gè)，說(shuō)明真核表達(dá)系統(tǒng)更適合金蓮花葉綠體基因異源表達(dá)試驗(yàn)。在分別與單、雙子葉遺傳轉(zhuǎn)化模式植物水稻、擬南芥的比較發(fā)現(xiàn)，金蓮花與水稻、擬南芥密碼子使用頻率差異較大的分別有24個(gè)和7 個(gè)，說(shuō)明雙子葉植物擬南芥更適合成為金蓮花葉綠體基因遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證理想的受體。

表5 金蓮花與其他生物密碼子偏好性比較

續(xù)表5

3 討論

密碼子是生物體內(nèi)信息傳遞的基本環(huán)節(jié)。在生物的遺傳密碼中，除色氨酸和蛋氨酸只有一個(gè)密碼子外，其他氨基酸都有一個(gè)以上的同義密碼子。編碼同一個(gè)氨基酸的同義密碼子在不同物種中使用的頻率是不相同的，即使同科屬的植物對(duì)密碼子的使用偏好性也存在差異。本研究中，金蓮花葉綠體基因組編碼精氨酸偏好使用密碼子AGA，但同是毛茛科的大兔葵葉綠體基因組偏好使用CGU[21]。研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因密碼子的偏好性雖然較弱，但可能也比核基因的要稍高一些。劉慧敏等[22]在研究杜仲轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性時(shí)發(fā)現(xiàn)，ENC 的平均值為54.31，擬南芥細(xì)胞核中編碼高親和性K+載體蛋白的POT 基因[23]和芍藥、牡丹、碧桃、蘋(píng)果細(xì)胞核中花分生組織決定基因APETALAI[9]的ENC 值均大于50，平均值為55 左右。糜子葉綠體基因組的ENC 平均值為49.26[24]，苦蕎葉綠體基因組整體的ENC 值為50.32[12]，金蓮花葉綠體的ENC 平均值為48.30。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，金蓮花的葉綠體基因組綜合每種氨基酸的高頻優(yōu)越密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子得到的9 個(gè)最優(yōu)密碼子，全部以A/U 結(jié)尾。結(jié)果顯示，不管是杜仲核基因轉(zhuǎn)錄組或擬南芥、芍藥等細(xì)胞核中的一些基因還是糜子、苦蕎、金蓮花葉綠體基因組，在堿基選擇時(shí)編碼區(qū)傾向于A＋U，且密碼子都偏好于使用A/U 結(jié)尾的密碼子。關(guān)于生物體對(duì)密碼子的選用偏好性研究，有人認(rèn)為，高等種子植物可以分為偏好A/U 結(jié)尾的雙子葉植物和偏好C/G 結(jié)尾的單子葉植物[25]，如雙子葉植物小桐子HXT基因密碼子的第3 位偏好使用A/U[26]，小麥CBL4 基因密碼子的第3 位偏好使用C/G[27]，但是最近發(fā)現(xiàn)，很多單子葉植物密碼子的偏好性分析如糜子、霍山石斛也偏好A/U 結(jié)尾[24，28]。也有研究認(rèn)為，低等生物中富含GC 最優(yōu)密碼子，GC 含量也較高；高等生物反之[29]。本試驗(yàn)的金蓮花屬于高等雙子葉植物，其密碼子偏向以A/U 結(jié)尾，但通過(guò)內(nèi)共生方式從低等生物藍(lán)細(xì)菌進(jìn)化成為葉綠體受到的影響因素還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過(guò)金蓮花葉綠體與原核、真核單細(xì)胞、單子葉、雙子葉模式生物的密碼子使用頻率比較發(fā)現(xiàn)，金蓮花葉綠體與原核的大腸桿菌和單子葉植物水稻的密碼子使用頻率差異較大，而與雙子葉植物苦蕎葉綠體的研究一致[12]。所以，真核的酵母菌更適合金蓮花葉綠體基因的宿主，雙子葉植物擬南芥更適合作為研究金蓮花轉(zhuǎn)基因研究的異源受體。