張姍姍，耿思宇，徐培林，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.中山大學(xué)教育部基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275）

油菜是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，油菜籽油是我國主要的食用油之一，油菜籽榨油后的餅粕是較好的動(dòng)物飼料，但是在生產(chǎn)中由于菜籽油中含有一定的芥子苷等有害物質(zhì)，限制了油菜餅粕的利用。因此，油菜的遺傳改良尤為重要。在油菜的遺傳改良中，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜高效轉(zhuǎn)化體系是進(jìn)行油菜重要功能基因解析、遺傳改良的必要條件。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是油菜轉(zhuǎn)基因研究中最常用的轉(zhuǎn)化方法。以往的研究發(fā)現(xiàn)，帶柄子葉[1]和下胚軸[2-3]是最常用的外植體；共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響，且共培養(yǎng)時(shí)間與基因型有關(guān)[4-7]。外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時(shí)間過短或過長，都不利于獲得較高的轉(zhuǎn)化率。尤其是當(dāng)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí)，外植體會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重褐化甚至死亡，顯著地降低了轉(zhuǎn)化率。與其他植物相比，油菜屬于難于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的物種，其在油菜遺傳轉(zhuǎn)化中存在著轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化過程中外植體易褐化死亡等問題。為解決這些問題，研究者對油菜遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。

有研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌侵染外植體前，對外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，向分化培養(yǎng)基中加入AgNO3等都可以提高油菜的轉(zhuǎn)化率[8-9]。即使是難再生的Brassica rapa，通過向培養(yǎng)基中加入乙烯抑制劑如氨乙氧基乙烯基甘氨酸（aminoethoxyvinylglycine）和硝酸銀等，也獲得了再生苗[10-13]。一些研究表明，硝酸銀對于苗充分再生是專性的[14-15]，尤其當(dāng)選擇標(biāo)記為卡那霉素時(shí)[16]。但是，AgNO3的濃度也不能過高，過高的Ag2+會(huì)對植物產(chǎn)生毒害。以往研究表明，在共培養(yǎng)前，外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)能夠顯著增加轉(zhuǎn)化率[17-20]。GONG 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AgNO3會(huì)誘導(dǎo)芥菜細(xì)胞中再生相關(guān)基因的表達(dá)。有研究表明，48 h 是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的最佳共培養(yǎng)時(shí)間[22]。李韓帥等[23]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌菌液OD600為0.9～1.2 是玉米農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的最適濃度。

為了更加系統(tǒng)地對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜基因轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，本試驗(yàn)全方位、系統(tǒng)地研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染濃度、培養(yǎng)基中添加AgNO3的濃度和共培養(yǎng)基pH 值等對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中抗性芽苗分化的影響，以期獲得優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜轉(zhuǎn)化體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

供試甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）為湘油15 號(hào)，其種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料研究所提供。

供試質(zhì)粒為pGRA1300，質(zhì)粒圖譜如圖1 所示。質(zhì)粒pGRA1300 的宿主菌為農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404；培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽和維生素均為分析純級(jí)；固化劑瓊脂粉購于鼎國生物工程有限公司；用于植物培養(yǎng)的氨基酸和植物激素均購于Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

以湘油15 號(hào)為試驗(yàn)材料，對影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的各種因素進(jìn)行單因素分析。除了所研究因素不同外，其他操作均按下述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行。

1.2.1 轉(zhuǎn)化方法 將5～6 d 苗齡的無菌苗下胚軸切成約0.5～1.0 cm 的切段或帶0.3 cm 左右子葉柄的子葉切下，置于MS＋2 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上分別進(jìn)行2 d 的預(yù)培養(yǎng)，然后用OD600為0.4 的菌液侵染5 min。之后用無菌濾紙吸干外植體上多余的菌液。將外植體放置在MS＋2 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d。然后將外植體放入含有300 mg/L Cef 的無菌水中沖洗2～3 次。洗掉附著在表面的菌體，放入MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3＋8 mg/L 草甘膦＋300 mg/L Cef 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織分化和芽苗再生。20 d 后用原培養(yǎng)基繼代一次。外植體分化出小芽后，轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基中使小芽繼續(xù)生長。待分化出的小芽苗長到3 cm 左右時(shí)，將小芽苗從外植體上切下，放入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 （1）預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。將下胚軸或子葉外植體，在MS＋2 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上分別進(jìn)行0，1，2，3，4 d 的預(yù)培養(yǎng)。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液濃度。將預(yù)培養(yǎng)過的下胚軸和子葉外植體，分別用OD600為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 的菌液侵染5 min。（3）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3的濃度。將轉(zhuǎn)化過的外植體，分別放在加有AgNO3濃度為0，10，20，30，40 μmol/L 的MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3＋8 mg/L 草甘膦＋300 mg/L Cef 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和芽苗分化。（4）共培養(yǎng)基pH 值。將感染過的下胚軸或子葉外植體，分別置于pH 值為5.0，5.2，5.4，5.8 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d。之后，按照上述轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后40 d 時(shí)，統(tǒng)計(jì)不同處理?xiàng)l件下外植體的出愈率和抗性芽苗分化率。

所有的試驗(yàn)處理均為3 次重復(fù)，所有的外植體培養(yǎng)均為（25±1）℃，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。轉(zhuǎn)化后篩選劑為草甘膦，抗性芽苗分化階段篩選壓為8 mg/L 草甘膦。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體預(yù)培養(yǎng)對抗性芽苗分化的影響

子葉和下胚軸外植體在不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下的出愈率和抗性芽苗分化率列于表1。不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下外植體愈傷組織生長和抗性芽苗分化情況如圖2、圖3 所示。

表1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對抗性芽苗分化的影響 %

從表1 和圖2、圖3-A 可以看出，預(yù)培養(yǎng)對于高效率轉(zhuǎn)化非常重要，預(yù)培養(yǎng)3 d 無論是對子葉外植體還是對下胚軸外植體，其出愈率和抗性芽苗分化率都是最高的，子葉和下胚軸的抗性芽苗最高分化率分別為23.77%和20.59%。因此，外植體在農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)前進(jìn)行3 d 預(yù)培養(yǎng)有利于獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

2.2 不同AgNO3 濃度對抗性芽苗分化的影響

外植體經(jīng)與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，置于附加有不同濃度AgNO3的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)42～56 d 后，在外植體上誘導(dǎo)出抗性芽苗；當(dāng)添加0～30 μmol/L AgNO3時(shí)，抗性芽苗分化率隨著AgNO3濃度的增加而提高；但是當(dāng)AgNO3濃度超過30 μmol/L 時(shí)，芽苗分化率會(huì)有所降低（圖3-B）。說明向培養(yǎng)基中添加AgNO3雖然可以提高抗性芽苗分化率，但是過高的AgNO3會(huì)對植物抗性芽苗的分化產(chǎn)生不利影響。在本試驗(yàn)條件下，在基因轉(zhuǎn)化中AgNO3的最佳使用濃度為30 μmol/L。此時(shí)，添加AgNO3的處理分別比不添加的處理，子葉和下胚軸的抗性芽苗分化率分別提高19.34，17.96 百分點(diǎn)（圖3-B）。

2.3 農(nóng)桿菌侵染的菌液OD600 對抗性芽苗分化的影響

通過對油菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后外植體生長發(fā)育的觀察發(fā)現(xiàn)，造成油菜基因轉(zhuǎn)化中轉(zhuǎn)化率低的主要原因是在油菜外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染和與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后外植體上會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象。而且外植體褐化的程度與農(nóng)桿菌侵染時(shí)農(nóng)桿菌菌液濃度有關(guān)。在農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為5 min 時(shí)，用不同濃度的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化后，外植體的出愈率和抗性芽苗的分化率列于表2。由表2 可知，農(nóng)桿菌菌液濃度對轉(zhuǎn)化率有顯著影響，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液OD600為1.0 時(shí)，子葉外植體的出愈率和抗性芽苗的分化率分別比菌液OD600為0.4 時(shí)下降34.69，15.38 百分點(diǎn)；下胚軸外植體的出愈率和抗性芽苗的分化率分別比菌液OD600為0.4 時(shí)下降26.15，13.39 百分點(diǎn)。從圖3-C可以看出，過高和過低的菌液濃度都不利于獲得高轉(zhuǎn)化效率，在本試驗(yàn)中，無論子葉還是下胚軸，芽苗的最大分化率均是在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4 時(shí)得到的，此時(shí)子葉和下胚軸的分化率分別為23.00%和18.95%。因此，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜基因轉(zhuǎn)化中，當(dāng)侵染時(shí)間為5 min 時(shí)，最佳的農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4。

表2 農(nóng)桿菌侵染濃度對抗性芽苗分化的影響 %

2.4 共培養(yǎng)基pH 值對抗性芽苗分化的影響

從圖3-D 可以看出，共培養(yǎng)基pH 值5.4 時(shí)，抗性芽苗的分化率最高；共培養(yǎng)基pH 值為5.0 和5.2時(shí)，外植體上褐化比較嚴(yán)重，可能是由于較低的共培養(yǎng)基pH 值有利于農(nóng)桿菌的生長。觀察發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)基pH 值為5.4 時(shí)，外植體上愈傷組織的生長狀態(tài)優(yōu)于其他3 種培養(yǎng)基上的愈傷組織，愈傷組織致密性較好；子葉和下胚軸外植體在共培養(yǎng)基pH 值為5.4 時(shí)，抗性芽苗分化率分別比共培養(yǎng)基pH 值為5.8 時(shí)提高9.97，6.18 百分點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外植體在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)后向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入一定量AgNO3，可以提高油菜轉(zhuǎn)化率，這與之前的研究結(jié)果相一致[24-26]。本研究還發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化農(nóng)桿菌侵染的菌液濃度和共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH 值也可以提高油菜的基因轉(zhuǎn)化率。有研究表明，植物進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙烯，乙烯的積累會(huì)造成外植體的褐化。過高濃度的農(nóng)桿菌侵染菌液也是造成外植體褐化的原因之一。AgNO3是乙烯的抑制劑，因此向農(nóng)桿菌侵染后誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加30 μmol/L AgNO3，以及在農(nóng)桿菌侵染時(shí)采用較低濃度的菌液侵染，可以減少油菜轉(zhuǎn)基因中外植體離體培養(yǎng)時(shí)乙烯產(chǎn)生量，減少外植體褐化，促進(jìn)抗性芽苗的分化[27]，農(nóng)桿菌菌液濃度以O(shè)D600為0.4 時(shí)較好，這與何業(yè)華等[28]的研究結(jié)果相似。共培養(yǎng)基pH 值在油菜轉(zhuǎn)化中的作用，前人很少研究。楊廣東等[29]在大白菜上的研究認(rèn)為，較低的共培養(yǎng)基pH 值（5.0）比較高的共培養(yǎng)基pH 值（5.8）誘芽率提高近2 倍。STACHEL 等[30]研究認(rèn)為，pH 值在5.8 以上會(huì)使根癌農(nóng)桿菌vir 基因處于不活化的狀態(tài)。因此，較低的共培養(yǎng)基pH 值有利于vir 基因的誘導(dǎo)。TAKASAKI等[31]研究認(rèn)為，pH 值為5.2 的共培養(yǎng)基比pH 值為5.8 的共培養(yǎng)基更有利于獲得較高的轉(zhuǎn)化率。本研究結(jié)果認(rèn)為，共培養(yǎng)基pH 值為5.4 有利于油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后抗性芽苗的分化。不同植物的最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間不同，任偉等[32]研究表明，紫花苜蓿在農(nóng)桿菌侵染前，預(yù)培養(yǎng)3 d 效果最好。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化的油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系為：外植體在農(nóng)桿菌侵染前進(jìn)行2～3 d 預(yù)培養(yǎng)、培養(yǎng)基中添加30 μmol/L AgNO3、農(nóng)桿菌侵染的菌液OD600為0.4、侵染5 min、共培養(yǎng)基的pH 值為5.4。