仇嘉昕，高玉平

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院生殖中心，上海 200000)

輔助生殖技術(shù)預后的改善主要包括胚胎質(zhì)量的優(yōu)化以及植入胚泡與子宮內(nèi)膜同步性的提高，各種促排卵和黃體支持技術(shù)的發(fā)展也是為了使子宮內(nèi)膜達到更接近自然妊娠植入期的狀態(tài)?，F(xiàn)在輔助生殖技術(shù)能夠通過控制性超排卵獲得多個胚胎并從中選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，但研究顯示即使是評分≥3 BB的優(yōu)質(zhì)囊胚，臨床妊娠率與持續(xù)妊娠率都分別只有44%和41%[1]，主要原因是子宮內(nèi)膜受損或者未處于“種植窗口期”[2]。全胚胎冷凍技術(shù)問世后，研究者們發(fā)現(xiàn)，有排卵的不孕婦女中移植凍胚與鮮胚的活產(chǎn)率并無統(tǒng)計學差異[3]，這說明冷凍技術(shù)不僅沒有影響胚胎的活力，反而為胚胎與子宮更好的同步性創(chuàng)造了條件。胚胎植入前子宮內(nèi)膜容受性的判斷經(jīng)歷了從形態(tài)學、影像學到分子生物學，從侵入性檢查到無創(chuàng)性操作的發(fā)展過程，本文就胞飲突、影像學、分子生物標志物等經(jīng)典子宮內(nèi)膜容受性判斷指標的最新進展作一綜述。

一、胞飲突

胞飲突是人類的著床期子宮內(nèi)膜表面微絨毛融合成的花狀膜突出物，其形態(tài)的變化根據(jù)掃描電鏡影象可分為發(fā)育中、發(fā)育完全、衰退3個階段；其數(shù)量及形態(tài)都與胚胎成功種植密切相關(guān)。

由于胞飲突在子宮內(nèi)膜黃體期持續(xù)存在，僅憑單純的胞飲突計數(shù)并不能精確描述胚胎種植窗口期[4]。近年來檢測胞飲突各形態(tài)比例作為一種無創(chuàng)的檢查方式重新受到生殖學家的關(guān)注。在一項前瞻性隊列研究中，172位參與者中有46位參與孕激素治療3～7 d后的胞飲突計數(shù)研究；余下126位參與孕激素開始治療后第6天胞飲突計數(shù)與妊娠結(jié)局關(guān)系的關(guān)系研究。結(jié)果顯示胞飲突總數(shù)在第6天達到最高峰，而發(fā)育中胞飲突的比例在第6天最低(平均值為49.40)，完全發(fā)育胞飲突的比例在第4天(平均值14.07)到第5天(平均值34.27)迅速上升并在第6天(平均值46.91)達到峰值；第二組實驗中妊娠與未孕婦女的年齡、內(nèi)分泌狀態(tài)、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無統(tǒng)計學差異，而成功妊娠者的胞飲突有著明顯更高的完全發(fā)育比例與更低的發(fā)育中比例(P均<0.05)。由此Jin等[5]提出胞飲突指數(shù)的概念：每一點發(fā)育完全胞飲突(FDP)百分數(shù)計1分，每一點發(fā)育中的胞飲突(DP)百分數(shù)計-1分，該實驗中妊娠婦女與未孕婦女胞飲突指數(shù)分別為(-2.11±2.84)和(-18.69±5.82)(P=0.006)，且低胞飲突指數(shù)(<-26.48)有著顯著的預后價值，相對于正常胞飲突指數(shù)妊娠率更低(53.3% vs.82.3%)。因此基于優(yōu)化計數(shù)方法的胞飲突測定可以反映內(nèi)膜狀態(tài)，與冷凍胚胎移植后成功妊娠率相關(guān)性顯著。

通過制作胞飲突計數(shù)與累積臨床妊娠率受試者工作曲線ROC，另一項隨機對照研究找到胞飲突計數(shù)的最佳截斷值為85(敏感性74.7%，特異性93.1%)。根據(jù)胞飲突計數(shù)分類，正?；颊?計數(shù)>85)的臨床妊娠率與持續(xù)妊娠率在第一次周期中都更高(分別為74.29% vs.19.77%和 62.86% vs. 11.86%)(P均<0.001)。盡管胞飲突完全不表達并不意味著絕對不孕，但這部分患者的流產(chǎn)率與反復移植失敗率更高，且根據(jù)胞飲突檢查個體化移植的妊娠率遠高于傳統(tǒng)胚胎移植(33.82% vs.8.11%，P=0.004)，因此在反復移植失敗患者群體中檢查胞飲突具有重要的意義[6]。

二、超聲學檢測

一般超聲從子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜回聲類型、內(nèi)膜蠕動、容積超聲、內(nèi)膜及內(nèi)膜下血供等方面對子宮內(nèi)膜容受性進行評價。通常認為HCG注射當日內(nèi)膜類型為三線型(A型)、移植日內(nèi)膜蠕動呈低頻次正向運動或相對靜止型(蠕動波頻率<3 次/分)時，妊娠率相對更高，而當內(nèi)膜容積小于2.5 cm3時臨床妊娠率明顯下降[7]。最佳著床內(nèi)膜厚度尚存爭議，單純厚度不能量化其功能，對IVF結(jié)局預測價值較低[8]。但一般都認為種植當日子宮內(nèi)膜厚度至少需要7 mm[9-10]。

最新大樣本回顧性隊列研究顯示，當內(nèi)膜厚度<7 mm時活產(chǎn)率更低，新生兒體重更輕[11]。提高子宮內(nèi)膜厚度對妊娠結(jié)局和新生兒預后都具有積極意義。中華醫(yī)學會生殖分會在2018年就提出需要對<7 mm的薄型子宮內(nèi)膜進行大劑量雌激素、仿生物電刺激、細胞集落刺激因子等聯(lián)合治療方案[12]。

血管生成在胚胎植入過程中扮演著重要角色，刺激血管生成藥物的應用可以提高輔助生殖預后[13]。血流動力學參數(shù)方面，子宮螺旋動脈可能比子宮動脈有著更高的參考價值。研究顯示，反復流產(chǎn)患者中，非妊娠組的子宮螺旋動脈搏動指數(shù)PI、阻力指數(shù)RI、血流速度收縮期峰值/舒張期峰值(S/D)均與妊娠組存在統(tǒng)計學差異[14]。

單一的超聲指標對內(nèi)膜容受性的預測價值有限，如何聯(lián)合多種超聲參數(shù)綜合評價內(nèi)膜狀態(tài)還需不斷探索。近年來，靶向分子超聲成像有望成為預測子宮內(nèi)膜容受性的新方向。這項技術(shù)將目的分子特異性抗體或配體連接到聲學造影劑表面構(gòu)筑靶向聲學造影劑，使聲學造影劑主動結(jié)合到靶區(qū)，進行特異性的超聲分子成像，這樣可以以無創(chuàng)的方式對內(nèi)膜容受性分子如血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2)等進行定位和定量，既有影像的檢測又有功能的檢測，為以后藥物靶向治療提供了可能性[15]。

三、基因表達檢測

隨著全基因組分析技術(shù)日趨成熟，子宮內(nèi)膜基因譜的研究吸引了更多關(guān)注，包括對正常女性的內(nèi)膜基因表達譜分析、反復種植失敗或復發(fā)性流產(chǎn)患者的內(nèi)膜基因表達譜分析、正常女性與不孕女性內(nèi)膜基因表達譜比較、自然周期與卵巢刺激周期內(nèi)膜基因表達譜比較。

Díaz-Gimeno等[16]構(gòu)建了一種子宮內(nèi)膜容受性芯片(endometrial receptivity array，ERA)，通過對種植期和種植前期的子宮內(nèi)膜基因表達進行t檢驗，找出238種表達程度變化大于3倍的基因(t<0.05)，使用生物信息學的預測程序評估子宮內(nèi)膜容受性的轉(zhuǎn)錄印記，將內(nèi)膜分為植入期，植入前期及植入后期，進而確定胚胎移植窗口期[16]。Hashimoto等[17]對50個反復種植失敗的不孕患者利用ERA在LH+7 d對子宮內(nèi)膜狀態(tài)進行檢測，發(fā)現(xiàn)12/50(24%)的患者子宮為非容受型，根據(jù)ERA進行個性化移植后容受型與非容受型的病人妊娠率分別為58.8%和50%，結(jié)果無顯著差異。另一項對至少一次整倍體胚胎移植失敗的群體檢測實驗發(fā)現(xiàn)，非種植窗的診斷率為22.5%[18]，這也映證Hashimoto團隊的研究：至少一次移植失敗群體中非容受型內(nèi)膜的檢出率在1/5以上，故在反復移植失敗群體中ERA是具有檢測價值的。但對于非反復種植失敗群體，ERA對于非容受性子宮的檢出率遠遠低于反復種植失敗人群(15% vs.27.5%)，所以ERA并不推薦作為胚胎移植人群的常規(guī)檢查[19]。

另一方面，ERA并非唯一基因檢測手段，也有研究團隊嘗試利用其他方法分析基因判斷內(nèi)膜狀態(tài)。Enciso等[20]構(gòu)建出另一種基于RT-qPCR基因表達分析的子宮內(nèi)膜容受性圖譜(endometrial receptivity map，ER map)，通過比較LH+2與LH+7的內(nèi)膜活檢標本，涉及細胞分裂增殖、細胞外基質(zhì)組織與信息交流、免疫反應、血管增殖等84個表達顯著變化的基因被選擇出來，利用其中40個基因構(gòu)建的辨別函數(shù)模型在正常月經(jīng)周期供體內(nèi)膜上的預測準確率達到100%。但研究的臨床應用價值仍需要更多非選擇性實驗和隨機對照實驗證實。

總體來說，基因檢測手段最大的問題是研究結(jié)果缺乏一致性。上百個利用微芯片檢測基因表達的研究中，只有很少幾個基因在兩個或以上的研究中被同時證實。另一方面，基因并不能代表參與胚胎種植等多過程的蛋白質(zhì)表達情況，基因預測內(nèi)膜容受性的價值還需要更多大樣本臨床研究來支撐。

四、非編碼RNA

在實際生物體中，胚胎植入過程相當復雜，大量信號轉(zhuǎn)錄通路涉及其中，找到合適的分子生物學標志物尤為關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)在真核生物細胞中廣泛存在，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，多數(shù)具有高度序列保守性，表達時序性與組織特異性，且易于檢測，這使得其成為熱門的分子標志。

研究者通過比較正常生育婦女內(nèi)膜植入前期與植入期、增殖晚期與分泌中期miRNA的表達變化，發(fā)現(xiàn)多種miRNA與子宮內(nèi)膜狀態(tài)相關(guān)[21]。miRNA的主要問題是可選擇的研究靶點很多但特異性太差，這與機體狀態(tài)的波動相關(guān)，導致各研究得出的結(jié)論缺乏一致性，沒有一個準確的miRNA種類有足夠的證據(jù)證明其意義。研究發(fā)現(xiàn)，利用邏輯回歸方程將血清miR-27a-3p與miR-124-3p表達濃度聯(lián)合構(gòu)建受試者工作曲線，敏感性與特異性分別達到91.6%和80%[22]。這項研究的樣本量小(n=12)，但提示利用多個miRNA構(gòu)建模型也許可以大大提高檢測有效性。

之前研究大多聚焦于子宮內(nèi)膜活檢組織中微小RNA的檢測。最近一項對正常婦女及慢性子宮內(nèi)膜炎患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清中的微小RNA水平也與子宮內(nèi)膜狀態(tài)有著密切聯(lián)系[22]。今年一項雙隊列研究分別比較分泌早期與分泌中期、正常受孕婦女與單獨種植失敗患者的血清miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)血清樣本未能提示分泌早期與中期的任何內(nèi)膜miRNA有顯著變化。然而，反復移植失敗患者中血清miR-30a-5p明顯上調(diào)[23]，這提示血清miRNA-30家族可能在種植失敗機制中起到一定作用，其對內(nèi)膜容受性判斷的價值仍有待商榷。另外，近200個長鏈非編碼RNA(lncRNA)也被發(fā)現(xiàn)在反復移植失敗及移植后正常受孕患者中存在差異表達[24]，提示lncRNA參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性。另一項對于子宮內(nèi)膜異位癥患者的研究表明，HOXA11-AS1雖然在內(nèi)異癥發(fā)展中起作用，但與內(nèi)異癥相關(guān)的不孕不存在明顯關(guān)聯(lián)[25]。盡管這項研究只局限于內(nèi)異癥群體，lncRNA作用具體機制及對ER判斷的臨床應用價值仍需要進一步研究。

五、細胞因子和各類受體

慢性子宮內(nèi)膜炎在大多數(shù)研究中被證實與不孕相關(guān)，子宮內(nèi)膜容受性受損是其中一項機制，這使得其成為研究子宮內(nèi)膜狀態(tài)的最好病理模型。整合素、IL-11、LIF等多種細胞因子均被發(fā)現(xiàn)在慢性子宮內(nèi)膜炎中表達下調(diào)，并且這些因子在其他導致不孕的疾病如輸卵管積水中也被發(fā)現(xiàn)有相應的表達下降[26]。隨后，更多的相關(guān)分子標志物被發(fā)現(xiàn)，包括谷酰胺還原酶、抑制性糖蛋白、HOXA10、肝素結(jié)合表皮細胞生長因子等。這些分子或是胞飲突表面的受體、分泌的細胞因子，與囊胚的粘附、侵入密切相關(guān)；或是調(diào)節(jié)胞飲突的表達、抑制內(nèi)膜上皮細胞的凋亡[7]。Edgell等[27]對于不明原因不孕婦女與生育能力正常婦女分泌中期宮腔液體的比較分析顯示，CSF3、IL8等5個因子在正常分泌中期隊列中濃度都明顯增高。集落刺激因子與LIF與妊娠結(jié)局的顯著關(guān)聯(lián)也同樣在其他研究中被證實[28]。

單個的細胞因子難以對內(nèi)膜狀態(tài)進行準確預測，2016年研究發(fā)現(xiàn)可以預測IVF失敗的模型能在子宮內(nèi)膜炎病人中提高治療有效性。Krylova等[26]將研究對象分為3組，分別是子宮內(nèi)膜炎治療后成功妊娠婦女、IVF治療后未能成功受孕婦女以及由于男方因素不孕的對照組，比較3組間雌孕激素受體分布、各種炎癥因子區(qū)域表達百分比和視覺密度。基于Wilks策略構(gòu)建出預測IVF結(jié)果的判別方程：P=0.04 A+126.0 B+3.7 C-23.5，O=0.09 A+83.9 B+1.9 C-13.4(P和O分別代表IVF的陽性和陰性結(jié)果，A=孕激素內(nèi)膜腺體上的表達，B=LIF內(nèi)膜腺體上的視覺密度，C=內(nèi)膜基質(zhì)TGFb1區(qū)域表達百分比)，這篇文章中建議對于將行IVF治療的子宮內(nèi)膜炎患者需同時行內(nèi)膜活檢組織學檢查，在無充分證據(jù)(增生或炎癥狀態(tài))阻礙內(nèi)膜種植的情況下需進行復合免疫組化檢查。盡管這一算法尚未被大型臨床試驗證實，但為將諸多內(nèi)膜預測指標聯(lián)系起來的方式提供一個方向。

六、子宮抽吸液中的蛋白組學與脂類分析

子宮內(nèi)膜分泌物是由諸多離子、蛋白、類固醇、氨基酸和碳水化合物組成的復合物，其對種植成功的必要性早已在子宮腺體敲除的母羊和大鼠上都得到證實，腺體敲除的實驗組在移入健康囊胚后都不能正常種植和內(nèi)膜蛻膜化[29]。

內(nèi)膜分泌物中各種蛋白對妊娠預后的評估是目前研究的焦點。最近兩項研究都分別對妊娠成功與失敗的IVF患者進行了子宮內(nèi)膜蛋白病例對照分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)組間顯著差異的蛋白基本上與細胞生長與黏附、能量通路、蛋白代謝與免疫反應相關(guān)，兩組實驗結(jié)果唯一的重疊蛋白是熱休克蛋白[30-31]。將氧分壓與不孕關(guān)聯(lián)起來的各種酶同樣可以作為判斷指標，抗氧化標志物如超氧化物歧化酶SOD，過氧化氫酶CAT越高則妊娠結(jié)局越好；而氧分壓標志脂質(zhì)過氧化酶則與結(jié)局呈負相關(guān)[32]。

蛋白被認為是預測內(nèi)膜容受性的可靠指標，但蛋白組學分析的低敏感性限制了其發(fā)展，且大多子宮分泌的蛋白都在血清中有表達，如若標本被血污染也會對結(jié)果造成較大干擾。因此提高子宮內(nèi)膜分泌物取樣和分析的技術(shù)是目前的突破口。近年來脂質(zhì)分析開始時興，許多脂類都對于人類生殖有著重要作用，且在胚胎植入階段具有特異性的表達，如溶血性磷脂酸通過與其受體LPA3結(jié)合調(diào)節(jié)胚胎種植與前列腺素的水平，而前列腺素也被發(fā)現(xiàn)在囊胚種植區(qū)高度聚集且在反復種植失敗的病人子宮中含量低下，應用COX2抑制劑可以完全阻斷妊娠發(fā)生[33]。雖然子宮內(nèi)膜抽吸液中的脂質(zhì)對胚胎定植意義重大，對于其定量檢測并根據(jù)檢測結(jié)果判斷內(nèi)膜容受性的方法仍未被報道，脂質(zhì)分析走向臨床還需要一定時間。

子宮抽吸檢查的準確性正逐漸被認可，甚至可以用于子宮內(nèi)膜病理檢查[34-35]。抽吸物內(nèi)容不僅可以做分子分析，還能進行細胞學分析綜合判斷子宮內(nèi)膜狀態(tài)。但是由于抽吸樣本量太少(1 ml)，檢測的一致性較差，不同實驗中抽吸液的組分都有著較大差異。盡管許多因子都被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)膜狀態(tài)相關(guān)，目前尚缺乏預測靈敏度與特異度都高的綜合模型。另外，技術(shù)方法仍受到很多限制，如內(nèi)膜分泌物易受到抽吸過程中上皮細胞內(nèi)容物的干擾、部分生物標志物由于抗體或交叉反應的原因無法檢測，所以提高檢測手段以及怎樣將諸多標志物結(jié)合形成完整體系將是未來的研究方向。

胚胎移植后的成功種植與妊娠涉及胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜狀態(tài)、內(nèi)膜與胚胎同步性等諸多相關(guān)因素，更有大量的細胞分子和信號通路關(guān)聯(lián)其中。通過準確判斷子宮內(nèi)膜狀態(tài)，確定種植窗口期并進行個體化移植是提高輔助生殖技術(shù)成功率的一項簡便可行的方案。目前判斷子宮內(nèi)膜的方法很多，既有宏觀上的超聲學檢查，也包括基因、RNA、細胞因子等微觀層面的檢測，但是沒有一項指標能夠作為單一的判斷標準。因此提高分子檢測技術(shù)、尋找更可靠的預測標志、進行大型臨床試驗確定不同指標的種植區(qū)間以及如何將各種檢測結(jié)果結(jié)合形成綜合體系將是今后努力的方向。標準ER判斷方案的誕生不僅能夠通過為病人制定個性化促排與移植方案提高臨床效率與結(jié)果，還能作為一項實驗技術(shù)用于不同卵巢刺激方案效果的比較等。