李道寬 彭蕓花△，2

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730010；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102)

白藜蘆醇(Resveratrol)是一類提取自葡萄籽、蘆薈、虎杖等植物的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[1]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)其與臨床抗腫瘤藥物聯(lián)合使用表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果[2-7]。其致死性的主要原因是腫瘤的治療失敗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移中，上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)扮演了重要促進作用[8]。逆轉(zhuǎn)由腫瘤微環(huán)境所導(dǎo)致的EMT將顯著延長宮頸癌患者總生存期[9-10]。目前已有多種治療策略通過逆轉(zhuǎn)EMT，阻止甚至逆轉(zhuǎn)癌癥的進一步惡化，其中聯(lián)合治療方法或聯(lián)合用藥是最常見的策略[11-13]。白藜蘆醇與5-FU聯(lián)合使用的抗腫瘤效果已在肝癌、乳腺癌等腫瘤中得到證實[14-15]，但是其在宮頸癌中對EMT的影響未見報道。因此，本研究選取宮頸癌細胞系HeLa細胞作為研究對象，探索白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移及其EMT的影響，為臨床更好地治療宮頸癌提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 HeLa細胞購買自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。H-DMEM培養(yǎng)基、FBS購自?？苽惞荆籑TT購自索萊寶公司；Transwell小室購自Millipore公司；MMP-2和MMP-9 Elisa檢測試劑盒購買自上海酶聯(lián)生物；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、ECL發(fā)光液購自碧云天公司；兔抗人N-cadherin多克隆抗體、兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人Twist1多克隆抗體、兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人Vimentin多克隆抗體購自博奧森生物公司，山羊抗兔熒光二抗購自CST公司。

1.2 方法 (1)細胞培養(yǎng)：用HDMEM培養(yǎng)基將HeLa細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3天換一次液，待細胞生長至80%融合度時，以1∶3進行傳代培養(yǎng)。(2)MTT實驗：將生長至80%融合度的HeLa細胞用胰酶消化，以含有10% FBS的HDMEM培養(yǎng)基配制成濃度為1×105個/mL的單細胞懸液，并以每孔100μL加到96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待貼壁后，白藜蘆醇和5-FU 均以0、10、20、40、80、160 μmol/L的濃度梯度加入到孔中；聯(lián)合組以50 μmol/L的白藜蘆醇聯(lián)合10、20、40、80、160 μmol/L 梯度的5-FU加入到孔中。加完藥后，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL ，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO溶解MTT，于490 nm處進行酶標儀檢測OD值。(3)Transwell小室遷移實驗：取處于對數(shù)生長期的HeLa細胞，按照約1×106個/mL配制無血清的單細胞懸液，于Tranwell小室上室中加入400 μL單細胞懸液，下室中加入含20% FBS的培養(yǎng)基，加藥，其中白藜蘆醇組加入終濃度為50 μmol/L的白藜蘆醇，5-FU組加入終濃度為50 μmol/L的5-FU，聯(lián)合組加入50 μmol/L的白藜蘆醇和50 μmol/L的5-FU，空白組加入相同體積的DMSO；待細胞均勻沉降后，放入培養(yǎng)箱作用24 h后取出，-20 ℃甲醇固定15 min，棉簽輕輕拭去未遷移過去的細胞，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌，拍照計數(shù)。(4)免疫熒光實驗檢測Vimentin表達：取處于對數(shù)生長期的HeLa細胞，按照約1×105個/孔，接種于6孔板，按照1.2(2)項下分組處理細胞，24 h后，PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌，透膜20 min，PBS洗滌，室溫封閉30 min，4 ℃孵育一抗過夜(其中以1∶200稀釋Vimentin抗體)，PBS洗滌，室溫孵育二抗2 h(以1∶400稀釋熒光二抗)，PBS洗滌，熒光顯微鏡拍照。(5)Elisa實驗檢測MMP-2、MMP-9表達：按照1.2(2)項下分組處理處于對數(shù)生長期的HeLa細胞24h后，收集上清，按照Elisa試劑盒說明書進行實驗：設(shè)置標準孔和實驗孔，標準孔加入梯度標準品，實驗孔加入待測樣品，37 ℃孵育30 min，洗滌，加入酶標試劑(空白孔不加)，37 ℃孵育30 min，洗滌，顯色10 min，終止顯色，15 min內(nèi)上機于450 nm處檢測OD值。(6)Western bloting實驗檢測N-cadherin、E-cadherin、Twist1、Snail1蛋白表達：取處于對數(shù)生長期的HeLa細胞，按照約1×106個/孔，接種于6孔板，待細胞生長至80%融合度時，按照1.2(2)項下分組處理細胞，藥物處理24 h后，吸取培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，加入RIPA裂解液在冰上裂解細胞，待細胞裂解后收集于離心管中，繼續(xù)裂解30 min，13 000 rpm離心，收集上清，測定蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存?zhèn)溆?。制膠：10%分離膠+5%濃縮膠；按蛋白濃度確定上樣量；然后經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育1.5h，PBS洗滌，ECL發(fā)光液顯色，X射線片顯影，拍照，用Image pro plus軟件對光密度值進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞增殖的影響 白藜蘆醇、5-FU以及二者聯(lián)合用藥均以濃度依賴的方式抑制HeLa細胞的增殖。其中在相同濃度下，聯(lián)合用藥對HeLa細胞增殖抑制率均大于5-FU 和白藜蘆醇單獨用藥，其中單獨用藥時白藜蘆醇的IC50為61.42 μmol/L，5-FU的IC50為26.13 μmol/L，聯(lián)合用藥IC50為18.75 μmol/L。見圖1。

圖1 白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合使用對HeLa細胞增殖的影響

2.2 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞遷移的影響 與空白組相比，白藜蘆醇組、5-FU組以及聯(lián)合組HeLa細胞遷移數(shù)目依次下降。見圖2。

圖2 白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合使用對HeLa細胞遷移的影響

2.3 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞Vimentin蛋白表達的影響 與空白組細胞相比，白藜蘆醇組、5-FU組以及聯(lián)合組細胞中Vimentin蛋白表達逐漸降低。見圖3。

圖3 白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合使用對HeLa細胞Vimentin蛋白表達的影響

2.4 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響 與空白組細胞相比，白藜蘆醇組、5-FU組以及聯(lián)合組細胞中N-cadherin蛋白表達逐漸下降，E-cadherin蛋白表達逐漸增加。見圖4。

圖4 白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合使用對HeLa細胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響

2.5 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞MMP-2、MMP-9表達的影響 與空白組相比，白藜蘆醇組、5-FU組以及聯(lián)合組細胞上清中MMP-2、MMP-9水平逐漸降低。與白藜蘆醇組和5-FU組相比，聯(lián)合組細胞上清中MMP-2、MMP-9水平顯著下降。見表1。

表1 各組細胞上清中MMP-2、MMP-9含量變化

注：與空白組相比，*P<0.05；與白藜蘆醇組和5-FU相比，△P<0.05。

2.6 白藜蘆醇聯(lián)合5-FU對HeLa細胞Twist1、Snail1表達的影響 與空白組相比，白藜蘆醇組、5-FU 組以及聯(lián)合組細胞中Twist1、Snail1蛋白含量逐漸降低。見圖5。

圖5 白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合使用對HeLa細胞Twist1、Snail1蛋白表達的影響

3 討 論

已有研究發(fā)現(xiàn)多種因子和細胞均可通過促進宮頸癌細胞EMT，誘導(dǎo)宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移[16-19]。抑制宮頸癌細胞EMT已經(jīng)在基礎(chǔ)和臨床實驗中成為抑制宮頸癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要藥物作用靶點。因此，開發(fā)挖掘有效治療EMT的藥物及其策略成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的主要研究方向。聯(lián)合用藥在基礎(chǔ)實驗和臨床研究中表現(xiàn)出良好的治療腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效果和前景。本研究將傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物5-FU與天然抗氧化藥物白藜蘆醇聯(lián)合使用在體外探索聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移的影響，并基于EMT初步探索抑制轉(zhuǎn)移的機制，為宮頸癌轉(zhuǎn)移治療提供基礎(chǔ)參考。

本研究首先通過對白藜蘆醇、5-FU以及聯(lián)合用藥抑制HeLa細胞的增殖情況進行檢測，MTT結(jié)果顯示聯(lián)合用藥的IC50明顯低于單獨用藥，其中單獨用藥時白藜蘆醇的IC50為61.42 μmol/L，5-FU的IC50為26.13 μmol/L，聯(lián)合白藜蘆醇時，5-FU的IC50為18.75 μmol/L。以上提示與白藜蘆醇的聯(lián)合使用提高了HeLa細胞對5-FU毒性的敏感性。經(jīng)過Transwell小室遷移實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對HeLa細胞遷移的抑制能力明顯高于單獨使用白藜蘆醇和5-FU。聯(lián)合用藥對腫瘤遷移抑制能力的增加是否是通過提高對EMT的抑制實現(xiàn)的，本研究在分子水平上進一步發(fā)現(xiàn)與單獨用藥相比，盡管單獨用藥同樣降低了細胞中Vimentin、N-cadherin以及MMP-2、MMP-9的表達，提高了E-cadherin蛋白表達，但聯(lián)合用藥卻更加明顯降低了HeLa細胞中Vimentin、N-cadherin以及MMP-2、MMP-9蛋白的表達，提高了E-cadherin蛋白表達。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白變化與EMT直接相關(guān)，其中E-cadherin、N-cadherin是維持細胞間連接的重要蛋白，Vimentin是維持細胞形態(tài)，參與細胞有絲分裂、分化的重要骨架蛋白[20-21]。在腫瘤分子生物學(xué)層面上，在多數(shù)上皮來源的惡性腫瘤中，E-cadherin表達下降，N-cadherin、Vimentin表達上升是細胞發(fā)生EMT的重要標志[22]。而在E-cadherin與Vimentin蛋白發(fā)生變化的時候，促進細胞轉(zhuǎn)移的重要蛋白MMPs因受到E-cadherin的抑制或Vimentin的促進從而發(fā)生相應(yīng)的表達變化[23]。在EMT過程中，Twist1、Snail1是調(diào)節(jié)EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。二者可識別E-cadherin基因啟動子上的特殊序列，抑制E-cadherin的表達，從而啟動EMT[24]。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可更加明顯地抑制Twist1、Snail1的蛋白含量，提示聯(lián)合用藥相比于單獨用藥對HeLa細胞EMT具有更強的抑制逆轉(zhuǎn)能力。

綜上可知，相比于單獨用藥，白藜蘆醇和5-FU的聯(lián)合用藥可降低5-FU的IC50，增強HeLa細胞對5-FU的敏感性，進一步探索發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥導(dǎo)致5-FU在較低濃度下具有較高的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制能力，在分子層面上這種較高的轉(zhuǎn)移抑制能力是基于對宮頸癌細胞EMT的更強抑制和逆轉(zhuǎn)實現(xiàn)的，這在臨床上有助于提高5-FU療效，同時降低腫瘤耐藥性和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，減輕5-FU的副作用。