李 磊 于芳芳 吳 月 張德發(fā) 高麗英 馬 萍

天津市第二人民醫(yī)院 300054

神經(jīng)梅毒是由梅毒螺旋體(TP)感染并侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)引起的CNS感染性疾病，其臨床表現(xiàn)形式復(fù)雜多樣，實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性，極易誤診，嚴(yán)重危害人類健康。有研究認(rèn)為，梅毒螺旋體(TP)的清除與機(jī)體的細(xì)胞免疫有關(guān)，T淋巴細(xì)胞對梅毒螺旋體所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)在其中起到了至關(guān)重要的作用[1]。為此本研究分析了神經(jīng)梅毒患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群的變化，為進(jìn)一步探討免疫系統(tǒng)對TP的作用提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年10月在我院住院治療的神經(jīng)梅毒患者32例作為神經(jīng)梅毒組，其中麻痹性癡呆型12例(男7/女5)、腦膜血管型10例(男6/女4)、眼梅毒型4例(男2/女2)、混合型6例(男3/女3)。選取同期健康體檢者35例為健康對照組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 目前國內(nèi)外均無神經(jīng)梅毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究確定入選標(biāo)準(zhǔn)參考中國CDC指南與共識(shí)[2]、美國CDC指南[3]、歐洲CDC指南[4]及相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]：(1)有神經(jīng)梅毒的臨床癥狀和體征，并且腦脊液檢查梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)陽

表1 兩組一般資料對比

性，快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)陽性。(2)任何階段的梅毒腦脊液RPR 陰性，但腦脊液梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)陽性，并具備下列2條者：①無其他已知原因引起的CSF蛋白≥0.5g/L并且白細(xì)胞(≥5×106/L)升高；②無其他已知原因所致的符合神經(jīng)梅毒的臨床癥狀和體征。其中符合(2)者為高度可疑神經(jīng)梅毒患者。所有入選患者血清TPPA、RPR均陽性；所有患者均行血清艾滋病病毒(HIV)抗體檢測，以排除HIV感染；腦脊液行墨汁染色、抗酸染色，以排除隱球菌感染及結(jié)核分枝桿菌感染。

1.3 研究方法 檢測方法：采取晨起空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血進(jìn)行檢測，采集量為2.0ml置于事先準(zhǔn)備好的有抗凝劑的試管中，同時(shí)將20μl標(biāo)記抗體置入另外一支試管中，將100μl加入抗凝劑的靜脈血樣置入標(biāo)記抗體試管內(nèi)，搖勻后染色，持續(xù)15min后加入事先準(zhǔn)備好的溶血素FACS 450μl，再次搖晃均勻并置于室溫下保存15min，離心5min棄上清液加入2ml PBS洗滌1次，最后加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞，將最后得到的樣本2h內(nèi)置入流式細(xì)胞儀中對T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測。所用試劑均購自美國BD公司，流式細(xì)胞儀型號為FACS Canto。

1.4 檢測指標(biāo) 檢測各組患者血清中CD45+、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+/CD56+、CD4+/CD8+，并計(jì)算百分率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。目前臨床多以CD45+代表白細(xì)胞共同抗原、CD3+代表T淋巴細(xì)胞分化抗原、CD4+代表輔助性T細(xì)胞分化抗原、CD8+代表抑制性T細(xì)胞分化抗原、CD16+/CD56+代表NK細(xì)胞分化抗原。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)(%)表示，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組定量資料比較時(shí)，當(dāng)方差齊則采用t檢驗(yàn)，方差不齊則采用U檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞亞群比較 神經(jīng)梅毒組CD4+、CD19+高于健康對照組，CD45+、CD3+、CD16+/CD56+低于健康對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD8+明顯低于健康對照組，CD4+/CD8+比值明顯高于健康對照組，兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表2。

表2 淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群檢測結(jié)果對比個(gè)/μl)

2.2 兩組淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群占比情況對比 神經(jīng)梅毒組CD3+%、CD8+%、CD16+/CD56+%均低于健康對照組，CD19+%高于健康對照組，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD4+%神經(jīng)梅毒組顯著高于健康對照組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表3。

表3 淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞亞群占比檢測結(jié)果對比

3 討論

神經(jīng)梅毒對人類危害大，致病機(jī)制不明，治療手段有限。目前研究認(rèn)為梅毒侵犯人體與患者的細(xì)胞免疫及體液免疫之間有著密切的聯(lián)系[8-9]?；赥淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞在人體免疫系統(tǒng)中強(qiáng)大的免疫調(diào)控作用，其在神經(jīng)梅毒患者體內(nèi)的起到什么樣的調(diào)節(jié)作用目前報(bào)道較少。本研究觀察并分析了神經(jīng)梅毒患者血清中淋巴細(xì)胞亞群的變化為進(jìn)一步研究神經(jīng)梅毒提供依據(jù)。結(jié)果神經(jīng)梅毒患者抑制性T淋巴細(xì)胞明顯低于健康對照組；輔助性T淋巴細(xì)胞與健康對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其高于健康對照組，T淋巴細(xì)胞總數(shù)低于健康對照組。表明神經(jīng)梅毒患者免疫調(diào)節(jié)失衡免疫功能降低，細(xì)胞免疫仍發(fā)揮主要免疫反應(yīng)，但不能有效清除體內(nèi)的梅毒螺旋體，導(dǎo)致患者體內(nèi)梅毒的持續(xù)存在及組織損傷[10]，其免疫機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

有研究指出B淋巴細(xì)胞在機(jī)體清除TP方面并不起主要作用，推測這可能與TP表面的黏多糖保護(hù)膜有關(guān)，黏多糖、宿主蛋白等組成的保護(hù)層TP表面，保護(hù)TP不易被清除[11]；這與本研究發(fā)現(xiàn)的B細(xì)胞(主要為CD19+細(xì)胞)在神經(jīng)梅毒組與健康對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異相同，推測B淋巴細(xì)胞在神經(jīng)梅毒患者中清除TP作用有限，或者B淋巴細(xì)胞通過直接或者間接的細(xì)胞間相互作用來調(diào)節(jié)免疫耐受及抑制過度活化的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致神經(jīng)梅毒患者體內(nèi)梅毒的持續(xù)存在。

NK細(xì)胞是一類不需要特殊抗體參與、無需組織相容性復(fù)合物(MHC)類分子表達(dá)即可直接殺傷病原體或靶細(xì)胞的免疫細(xì)胞亞群[12]，與巨噬細(xì)胞構(gòu)成第一道免疫防線，起監(jiān)視功能并分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NK細(xì)胞在清除機(jī)體TP感染方面起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞數(shù)在神經(jīng)梅毒與健康對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其明顯低于健康對照組，推測神經(jīng)梅毒患者下調(diào)或者降低NK細(xì)胞細(xì)胞毒功能，或者NK細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子功能減低，減低其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，最終導(dǎo)致機(jī)體清除TP功能受限，TP持續(xù)破壞神經(jīng)組織導(dǎo)致患者神經(jīng)損傷。

在神經(jīng)梅毒患者中，外周血中輔助性T淋巴細(xì)胞百分比明顯升高，抑制性T淋巴細(xì)胞百分比較健康對照組降低，這與Li等[13]研究早期梅毒患者發(fā)現(xiàn)外周血中輔助性T淋巴細(xì)胞亞群百分比低于健康人群，抑制性T淋巴細(xì)胞亞群百分比高于健康人群，結(jié)果相反。提示梅毒感染不同階段淋巴細(xì)胞免疫功能的變化，神經(jīng)梅毒患者細(xì)胞免疫功能仍起主要作用，但清除TP功能受損；神經(jīng)梅毒患者外周血中CD3+%、CD16+/CD56+%較健康對照組有降低，但降低不明顯，提示成熟T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞在神經(jīng)梅毒患者中均降低，機(jī)體免疫力低于健康對照組。

總之神經(jīng)梅毒患者免疫功能降低、紊亂，機(jī)體清除TP功能受損，應(yīng)該進(jìn)一步研究TP與機(jī)體免疫功能之間的復(fù)雜關(guān)系，為臨床預(yù)防和治愈梅毒提供新的方法和手段。