林敏華 鄧桂清 歐宇軒 陳芷琳 黃佳栓 康美霞 李錦新

1 廣州醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，廣東省廣州市 511436； 2 廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院；3 廣州醫(yī)科大學(xué)市一臨床學(xué)院； 4 廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院； 5 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

兒童型非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種除外酒精及其他明確肝損害因素，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1]。我國(guó)兒童型NAFLD發(fā)病率為3.4%，隨著兒童超重、肥胖發(fā)生率增加，NAFLD已成為我國(guó)兒童最常見的慢性肝病之一[2]，若NAFLD長(zhǎng)期遷延不愈，可導(dǎo)致患兒在成年時(shí)罹患心腦血管病、糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高。目前尚未證實(shí)何種藥物治療兒童型NAFLD有效，有關(guān)發(fā)病機(jī)制、藥物治療研究甚少?；A(chǔ)研究方面，兒童型NAFLD造模文獻(xiàn)也較少。因此本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食誘導(dǎo)建立幼鼠NAFLD模型，為基礎(chǔ)研究提供可靠且病變符合兒童型NAFLD的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3周齡雄性SD幼鼠SPF級(jí)，體質(zhì)量50～80g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒，葡萄糖試劑盒，甘油三酯試劑盒，總膽固醇試劑盒，高密度脂蛋白試劑盒，低密度脂蛋白試劑盒, 上海科華生物工程股份有限公司；大鼠胰島素(INS)ELISA Kit，武漢基因美生物科技有限公司；7020型全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；ST-360型酶標(biāo)分析儀，上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料的制備：委托廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備高脂飼料，能量為5.24kcal/g，具體配比為：酪蛋白≥88%為200g/kg，L-胱氨酸為3g/kg，麥芽糖糊精為125g/kg，蔗糖為68.8g/kg，纖維素為50g/kg，豆油為25g/kg，豬油為245g/kg，礦物質(zhì)AIN-93為35g/kg，維生素AIN-93為10g/kg，氯化膽堿為2.5g/kg；普通飼料能量3.4kcal/g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3.2 動(dòng)物模型的制備：3周齡雄性SD幼鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，對(duì)照組每天喂養(yǎng)普通飼料，造模組每天喂養(yǎng)高脂飼料，每組予自由飲水和自由進(jìn)食，連續(xù)飼養(yǎng)6周。廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔無塵、適宜溫濕度、良好采光的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況：實(shí)驗(yàn)期間，觀察大鼠生活習(xí)性、毛發(fā)顏色、行為習(xí)慣等特點(diǎn)，每周記錄幼鼠體重及進(jìn)食量。

1.4.2 肝臟質(zhì)量與肝指數(shù)： 6周后，大鼠禁食24h，腹腔注射1%戊巴比妥4mg/kg麻醉，心臟采血5ml，取肝稱重。肝指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。

1.4.3 血清生化指標(biāo)檢查： 檢測(cè)血清中門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血糖(GLU)、膽固醇(CHO)、胰島素(INS)含量，計(jì)算胰島素抵抗(HOMA-IR，HOMA-IR=GLU×INS/22.5)。

1.4.4 肝組織病理學(xué)檢查： (1)石蠟切片與HE染色：新鮮肝臟用bouin液固定24h，經(jīng)梯度酒精脫水，TO透明劑透明，石蠟包埋，切片后，行HE染色。鏡下觀察脂肪變情況并進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評(píng)分(NAFLD activity score，NAS)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南。(2)冰凍切片與油紅染色：新鮮組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度蔗糖溶液脫水，OCT包埋，冰凍切片后，行油紅染色。觀察肝組織脂質(zhì)沉積情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)期間，造模組體質(zhì)量增長(zhǎng)較對(duì)照組稍快(圖1)，每周平均進(jìn)食熱量均高于對(duì)照組(圖2)，每周平均進(jìn)食量均低于對(duì)照組(圖3)。6周后，造模組體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見表1，大鼠毛發(fā)稍蓬松，毛色變暗。

圖1各組幼鼠每周體重增長(zhǎng)變化曲線 圖2各組幼鼠平均進(jìn)食熱量曲線 圖3每周每只幼鼠進(jìn)食總量變化曲線

2.2 肝臟質(zhì)量與肝指數(shù) 對(duì)照組肝臟呈紅褐色，邊緣尖銳，質(zhì)地柔軟，富有彈性。造模組肝臟體積增大，外表可見廣泛分布的黃色細(xì)顆粒，肝臟色澤暗沉，邊緣厚鈍，有油膩感，彈性較差，造模組肝臟質(zhì)量、肝指數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 血清相關(guān)指標(biāo) 造模組GLU較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模組HOMA-IR較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；造模組 AST、ALT、HDL、LDL、TG、CHO、INS 較對(duì)照組均有所上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 高脂飲食對(duì)幼鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 肝組織病理學(xué)改變

2.4.1 HE染色。光鏡下觀察對(duì)照組幼鼠肝組織(圖4)，顯示正常肝組織結(jié)構(gòu)。造模組幼鼠肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞核被推向一邊，部分區(qū)域可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

NAS評(píng)分：造模組評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且造模組中87.5%大鼠肝脂肪變程度>33%，提示可診斷為NAFLD，見表2。

2.4.2 油紅染色。對(duì)照組肝組織幾乎無著色，造模組肝細(xì)胞中的脂滴被染成橘紅色(圖6)。

3 討論

圖4 對(duì)照組(HE染色，×400)

圖5 造模組(HE染色，×400)

組別肝細(xì)胞脂肪變<5%5%～33%34%～66%>66%總分(x±s)對(duì)照組62000.25±0.46造模組01342.37±0.74?

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01。

圖6 造模組(油紅染色，×400)

目前認(rèn)為二次打擊是NAFLD主要發(fā)病機(jī)制，胰島素抵抗引起肝臟中脂質(zhì)堆積，是NAFLD的第一次打擊，第二次打擊是氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷。長(zhǎng)期食用高脂飼料的幼鼠極易發(fā)生IR[8]，游離脂肪酸(FFA)增多,脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，脂類物質(zhì)CHO、TG蓄積于肝臟，VLDL也相應(yīng)增加。過量的FFA有肝細(xì)胞毒性，可加速線粒體β氧化，產(chǎn)生大量的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)觸發(fā)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物；脂質(zhì)過氧化物增強(qiáng)ROS毒性并減少ROS滅活；如此一來，形成了ROS增多和脂質(zhì)過氧化增多的惡性循環(huán)[9-11]，最終脂質(zhì)大量累積，發(fā)展為非酒精性脂肪肝病。

從發(fā)病機(jī)制來看，造模組幼鼠肝重與肝指數(shù)較對(duì)照組高，與脂肪物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用有關(guān)。肝組織出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)和脂肪變，因?yàn)橹|(zhì)積聚可增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)[12]，這些炎癥因子的升高也可提示肝組織的病變情況[13]。

部分NAFLD患兒會(huì)伴隨有血脂與肝酶的異常和胰島素抵抗，然而造模組AST、ALT、HDL、LDL、TG、CHO、INS等有上升趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡苁且?yàn)椴⒎撬谢純壕憩F(xiàn)為肝酶譜和血脂代謝的異常，故目前肝酶譜和血脂指標(biāo)都不作為獨(dú)立的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，特別是ALT，在臨床上盡管ALT正常也不可輕易排除NAFLD，ALT正常的患兒仍可有肝組織脂肪變[15]。另外，隨著胰島素敏感性和糖處理能力下降，患兒容易并發(fā)高血糖和高胰島素血癥[16]。雖然造模組INS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但GLU和HOMA-IR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且HOMA-IR被認(rèn)為與NAFLD存在正相關(guān)關(guān)系[17]。

本研究造模組體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)明顯增高，病理改變、NAS評(píng)分結(jié)果符合兒童型NAFLD的病理特征，存在高血糖、胰島素抵抗現(xiàn)象，證明高脂飲食可誘導(dǎo)幼鼠NAFLD，可為未來該病發(fā)病機(jī)制、防治等方面研究提供可靠的動(dòng)物模型。