董文燊，譚興起，邵留英，李 清，瞿發(fā)林*，沈夢霞

0 引言

假蒟PipersarmentosumRoxb.為胡椒科Piperaceae胡椒屬Piper植物，又名蛤蔞、假蔞、山蔞等，多年生、匍匐、逐節(jié)生根草本，具有溫中散寒、祛風(fēng)利濕、消腫止痛之功效。假蒟是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，主要產(chǎn)于中國廣東、廣西、福建、云南、貴州及西藏(墨脫)各省區(qū)，生于林下或村旁濕地上，一年四季均可采收。其所含的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、木脂素、有機酸、生物堿等。目前已報道的關(guān)于假蒟藥理作用的研究主要是抑菌、殺蟲、抗炎、解熱、抗氧化等方面[1-2]。

近年來，同屬胡椒屬的其他植物，如大葉蒟PiperlaetispicumC.DC和光軸苧葉蒟Piperboehmeriaefolium(Miq.) C.DC.var.tonkinense.C.DC.相繼被報道具有抗抑郁活性。根據(jù)同屬近源的關(guān)系，本課題組前期對假蒟的抗抑郁活性進行研究，結(jié)果顯示，其具有明顯的抗抑郁作用[3]。大葉蒟和光軸苧葉蒟中抗抑郁活性成分為酰胺類生物堿[4-5]，提示假蒟中抗抑郁活性成分也可能是此類化合物，而胡椒堿為假蒟中酰胺類生物堿代表性成分，也是目前較易獲得的化合物，并且有研究表明，胡椒堿具有抗抑郁藥理作用[6-8]。因此，本文以胡椒堿為對照，采用酸性染色比色法[9-10]，以總生物堿及浸膏量為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)選提取假蒟的最佳工藝，為假蒟的進一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，752N紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，EI-300J型電子天平(常州市天之平儀器設(shè)備有限公司)，RE-5C式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，YB-IA型真空恒溫干燥箱(天津市金洲科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 假蒟(采集于廣東省陽春市永寧鎮(zhèn)，批號：20171220，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第九○四醫(yī)院瞿發(fā)林主任藥師鑒定為胡椒科假蒟的莖、葉)；胡椒堿對照品(含量以98.9%計，批號：110775-201706，中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格20 mg)；甲醇(色譜醇)；乙醇、鹽酸、醋酸、醋酸鈉、氨水、二氯甲烷、無水硫酸鈉、溴甲酚綠(均為分析純)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 溴甲酚綠緩沖液的制備 取溴甲酚綠0.1 g，加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)10 ml使溶解，再加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)稀釋至100 ml，即得。

2.1.2 溶液的制備 ①供試品溶液的制備：稱取假蒟提取物1 g，用0.5 mol/L的鹽酸溶液20 ml，超聲溶解，過濾，濾液用氨水調(diào)pH為9～10，加入等量的二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，濃縮并定容至25 ml量瓶中，取5.0 ml轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入5 ml溴甲酚綠緩沖液和15 ml二氯甲烷，順時針振搖1 min，靜置1 h，分取二氯甲烷層并用無水硫酸鈉進行脫水，將二氯甲烷作為供試品溶液。②對照品溶液的制備：精密稱取胡椒堿對照品17.42 mg，置50 ml量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。取對照品儲備溶液1 ml、加溴甲酚綠緩沖液5 ml和二氯甲烷20 ml置于分液漏斗中，同法制作對照品溶液。③空白對照溶液的制備：取5 ml溴甲酚綠緩沖液和20 ml二氯甲烷同法制作空白對照溶液。

2.1.3 專屬性試驗 對空白對照溶液進行全波長掃描(200～800 nm)，并進行基線校正，然后對供試品溶液和對照品溶液進行全波長掃描，選取最大吸收波長415 nm作為檢測波長。見圖1。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 制成含胡椒堿251.21、276.33、301.45、326.57、351.69和376.82 μg/ml的對照品溶液，按“2.1.2”項下方法操作，在415 nm波長測定吸光度，以胡椒堿量為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.004 2x-0.818 5，r=0.999 3，線性范圍為251.21～376.82 μg/ml。

圖1 紫外可見光掃描圖

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液，在415 nm波長連續(xù)測定5次吸光度，所測得吸光度的RSD為0.25%，表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 吸取同一份供試品溶液，每隔30 min測1次吸光度，供試品溶液在4 h內(nèi)吸光度的RSD為1.48%，結(jié)果表明，供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批假蒟提取物適量，共5份，按“2.2.1”項下方法操作，同法測定。結(jié)果假蒟提取物中平均吸光度為0.536，RSD為1.16%。

2.1.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的假蒟提取物6份，分別加入對照品儲備液(胡椒堿348.4 μg/ml)0.5 ml，按“2.1.2”項下方法操作，同法測定。結(jié)果平均回收率為100.23%，RSD為1.29%。見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.2 浸膏得率的測定

2.2.1 蒸發(fā)皿的預(yù)處理 蒸發(fā)皿105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W1，繼續(xù)烘1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W2，當(dāng)W1與W2之差絕對值≤0.3 mg，置干燥器備用。

2.2.2 浸膏量的測定 假蒟藥材提取液60 ℃減壓濃縮至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60 ℃減壓干燥5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W3，繼續(xù)干燥1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W4，直到W3與W4之差絕對值≤0.3 mg。浸膏量：W4-W2。

2.3 正交實驗的設(shè)計及實驗結(jié)果

2.3.1 提取方法 將假蒟的干燥莖和葉，切段成直經(jīng)為0.5～1.5 cm，稱取80 g于三頸圓底燒瓶中，按照煎煮因素水平回流提取(煎煮前先將藥材浸泡1 h)，提取液用紗布壓榨濾過，得假蒟藥材提取液。

2.3.2 正交試驗 選擇乙醇用量、乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)作為參考因素，以假蒟提取物重量和總生物堿含量作為評價指標(biāo)，用L9(34)正交試驗表對以上4個因素進行考察，見表2。

表2 正交試驗因素水平表

2.3.3 正交實驗結(jié)果 見表3、表4。

表3 正交試驗結(jié)果

注：總藥材假蒟為80 g

表4 方差分析

從表2、表3結(jié)果可以看出：4個因素對試驗結(jié)果的影響程度為B>D>C>A，依次為乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和乙醇用量。因素B的F=149.671 3，P<0.01，因素D的F=142.231 9，P<0.01，因素B、D均具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明乙醇濃度(B)和提取次數(shù)(D)對試驗結(jié)果具有極顯著性影響。本試驗結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝應(yīng)為A2B2C1D3，即10倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次1 h。

2.4 驗證試驗 按照正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝，制備5批樣品，測定假蒟提取物重量和總生物堿含量，進行綜合評分，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

從表5結(jié)果可知，重復(fù)優(yōu)選工藝條件中假蒟提取物的重量為14.53～15.42 g，總生物堿的含量為99.64～105.00 mg，兩者的綜合評分值在0.95～1.00，表明該工藝方法穩(wěn)定；平行試驗的2個檢測指標(biāo)的RSD均小于2.4%，表明該方法重現(xiàn)性好，可為假蒟的進一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

3 討論

目前，對假蒟藥材的質(zhì)量評價研究主要集中在α-細辛腦這一成分上，本試驗需對藥材進行煎煮、濃縮、干燥等加熱環(huán)節(jié)，而α-細辛腦屬揮發(fā)油類，不適于假蒟藥材提取物的質(zhì)量評價。也有文獻報道，以鹽酸小檗堿為對照，采用酸性染色比色法，對假蒟不同部位(根、莖、葉)總生物堿進行含量測定[11]。本課題組主要研究目的為假蒟抗抑郁作用，而胡椒堿為假蒟中酰胺類生物堿代表性成分，也是目前較易獲得的化合物?，F(xiàn)代研究表明，胡椒堿可通過調(diào)節(jié)單胺氧化酶發(fā)揮抗抑郁的藥理作用[6-8]。因此，本文以胡椒堿為對照，評價假蒟中總生物堿的提取工藝，其專屬性強，更具有研究意義。 在預(yù)試驗中曾采用高效液相色譜法測定假蒟藥材提取物中胡椒堿含量，但含量極少。因此，本試驗采用酸性染色比色法測定總生物堿含量，而其含量的高低與穩(wěn)定易受酸性染料的種類、用量及pH值的影響。因此，本方法考察了溴麝香草酚藍、溴甲酚綠和溴酚藍3種酸性染料對胡椒堿的絡(luò)合作用，結(jié)果溴甲酚綠染料絡(luò)合反應(yīng)效果最好。同時，對溴甲酚綠緩沖液用量(1、3、5、7、9 ml)和pH(pH 3.5～5.5)進行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液用量達到5 ml時，既能達到絡(luò)合反應(yīng)完全，且緩沖液pH 4.5時，絡(luò)合反應(yīng)溶液的吸光度最穩(wěn)定，最終選擇5 ml溴甲酚綠緩沖液(pH 4.5)作為反應(yīng)介質(zhì)系統(tǒng)。

正交試驗結(jié)果采用假蒟藥材提取浸膏量及總生物堿含量2個指標(biāo)，因此以加權(quán)評分的方法計算綜合評分，根據(jù)2個指標(biāo)的重要程度，將假蒟提取浸膏量和總生物堿含量的權(quán)重系數(shù)分別定為0.3和0.7，二者的綜合評分為[(浸膏重量/max浸膏重量×0.3)+(總生物堿含量/max總生物堿含量×0.7)]。

以胡椒堿為對照，優(yōu)選假蒟中總生物堿的提取工藝尚未見報道，本文采用酸性染色比色法，以假蒟提取物重量及總生物堿為指標(biāo)，通過正交試驗法優(yōu)選出了假蒟的最佳提取工藝，經(jīng)過5批藥材最佳提取工藝驗證，結(jié)果表明，該提取工藝簡單、可行、穩(wěn)定，為假蒟的開發(fā)與使用提供了一定的理論依據(jù)。