鄭學松，胡善策，馮廣才

0 引言

胰腺炎是一種多由膽結(jié)石和酒精濫用等致病因素誘發(fā)的無菌性胰腺炎癥[1]，以胰蛋白酶異常激活引起的急性炎癥反應為病理特征[2]。研究表明，胰蛋白酶異常激活引起的炎癥反應不僅可導致胰腺損傷，還可進一步發(fā)展成為全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征[3]?，F(xiàn)階段，初期胰腺炎患者多用胃腸減壓的方法緩解腹脹腹痛，嚴重胰腺炎患者多用手術(shù)清除胰腺壞死組織，阻止臨床癥狀惡化。而最近機制研究發(fā)現(xiàn)，胰腺泡細胞損傷是胰腺炎發(fā)生的起始狀態(tài)，在胰腺炎形成過程中發(fā)揮重要作用，因此，減輕胰腺泡細胞損傷是治療胰腺炎的理想方法[4]。有報道，炎癥調(diào)節(jié)因子微小型RNA-30a-5p(MicroRNA-30a-5p，miR-30a-5p)可通過降低高溫需要A1蛋白基因的轉(zhuǎn)錄抑制胰腺泡細胞中炎癥因子的釋放，減輕胰腺泡細胞損傷[5]。同時研究表明，自噬效應蛋白Beclin1在胰腺炎組織中高度表達，細胞自噬顯著促進胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[6]。而在小細胞肺癌中，miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)Beclin1，顯著抑制細胞自噬的發(fā)生[7]。本文通過建立胰腺泡細胞損傷模型，對miR-30a-5p與Beclin1的作用機制及影響進行深入探究，為胰腺炎臨床治療提供新的思路。

1 材料方法

1.1 實驗材料 Ham′s F12K培養(yǎng)液、牛膽酸鈉、脂肪酶及淀粉酶試劑盒購自美國Sigma；胎牛血清購自美國Gibco；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、MMT試劑盒、Hoechst試劑盒、RIPA裂解液及BCA試劑盒購自上海碧云天；Trizol、總RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒及脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher；引物購自北京六合華大基因；腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)及IL-1β ELISA試劑盒購自美國Invirtrogen；實驗所用抗體均購自美國Cell Signaling Technology。

大鼠胰腺泡細胞株AR42J由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供。以含有1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的Ham′s F12K培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。在融合率達到85%時進行傳代，濃度約1×104個/ml。將細胞分為Control組、Model組、mimic mock組及miR-30a-5p mimic組。Control組為空白對照，Model組用500 μmol/L的牛膽酸鈉進行處理;mimic mock組經(jīng)牛膽酸鈉處理后轉(zhuǎn)染mimic mock，即miR-30a-5p mimic隨機打亂后的無意義的基因序列；miR-30a-5p mimic組則轉(zhuǎn)染等量的miR-30a-5p mimic。轉(zhuǎn)染步驟參考試劑盒說明書。

1.2 實驗方法

1.2.1 RT-PCR檢測miR-30a-5p的mRNA水平 將“1.1”項中各組細胞加入Trizol，在通風櫥內(nèi)進行總RNA抽提，抽提步驟參考試劑盒說明書。定量分析后，進行反轉(zhuǎn)錄，每組取等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄步驟參考試劑盒說明書。然后利用實時定量PCR試劑盒對各組樣品進行定量分析。

1.2.2 MTT檢測細胞存活 將細胞分為Control組、Model組、miR-30a-5p mimic組及pc-Beclin1+miR-30a-5p mimic組。Control組、Model組、miR-30a-5p mimic組處理方式與“1.1”項中相同，pc-Beclin1+miR-30a-5p mimic組細胞經(jīng)牛膽酸鈉處理后，利用pcDNA Beclin1(pc-Beclin1)與miR-30a-5p mimic共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟參考試劑盒說明書。

將5 mg/ml的MTT溶液加入“1.1”項及“1.2.2”項中各組細胞，4 h后進行終止。棄去板孔中培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜輕柔震蕩，使結(jié)晶物充分溶解。然后利用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD 490 nm處測量吸光值。

1.2.3 Hoechst檢測細胞凋亡 將“1.1”項及“1.2.2”項中各組細胞進行固定，并利用Hoechst染色試劑盒染色，步驟參考試劑盒說明書。利用熒光顯微鏡進行檢測，激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為460 nm。細胞核呈藍色。

1.2.4 試劑盒檢測脂肪酶及淀粉酶活性 試劑盒利用偶聯(lián)酶促反應來檢測“1.1”項及“1.2.2”項各組細胞脂肪酶及淀粉酶活性，脂肪酶在波長為570 nm處進行比色，淀粉酶在波長為405 nm處進行比色，步驟參考試劑盒說明書。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-1β濃度 “1.1”項及“1.2.2”項中各組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度測定步驟參考Invirtrogen ELISA試劑盒說明書。避光顯色后，利用酶標儀檢測各組樣品OD值，并按說明書公式計算其濃度。

1.2.6 免疫印跡檢測蛋白表達 RIPA裂解“1.1”項及“1.2.2”項中各組細胞，提取細胞總蛋白。BCA試劑盒定量并調(diào)平各組蛋白濃度。取各組蛋白30 mg，通過10% SDS-PAGE將蛋白分離，半干轉(zhuǎn)膜法進行轉(zhuǎn)移至PVDF膜。牛奶室溫封閉2.5 h，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育1 h，曝光顯色，并以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.7 熒光素酶報告實驗 將生物信息預測的miR-30a-5p和Beclin1相互結(jié)合片段，利用PCR擴增并插入到熒光素酶報告酶載體中，用于構(gòu)建Beclin1野生型(wt)質(zhì)粒。利用基因突變技術(shù)對兩者相互結(jié)合片段上個別位點進行突變，用于構(gòu)建Beclin1突變型(mut)質(zhì)粒。將miR-30a-5p mimic與Beclin1wt或Beclin1mut共同轉(zhuǎn)染AR42J細胞，24 h后檢測熒光素酶活性。

1.2.8 免疫熒光檢測LC3表達 細胞爬片培養(yǎng)12 h移至培養(yǎng)皿中，4%的多聚甲醛4 ℃固定后，利用PBS配制的0.1% Triton X-100室溫通透20 min。加5% BSA室溫封閉30 min后，一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗37 ℃孵育1 h。避光加入DAPI復染細胞核，封片液封片。熒光顯微鏡觀察采集圖像，對光斑進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。首先進行正態(tài)分布和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 牛膽酸鈉處理胰腺泡細胞濃度的選取 結(jié)果表明，對于胰腺泡細胞，牛膽酸鈉的半數(shù)抑制濃度為513.2 μmol/L，最終選取牛膽酸鈉用藥濃度為500 μmol/L用于后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 不同濃度牛膽酸鈉對胰腺泡細胞抑制率的影響

2.2 胰腺泡細胞損傷及miR-30a-5p mimic對miR-30a-5p的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中miR-30a-5p的mRNA水平顯著降低(P<0.01，圖2A)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中miR-30a-5p的mRNA水平顯著升高(P<0.01，圖2B)。

2.3 胰腺泡細胞損傷及miR-30a-5p mimic對細胞存活、脂肪酶及淀粉酶的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞存活率顯著降低(P<0.01，圖3B)，細胞大量凋亡(圖3A)，凋亡細胞百分比顯著升高(P<0.01，圖3C)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中胰腺泡細胞存活率顯著升高(P<0.01，圖3B)，凋亡細胞顯著減少(圖3A)，凋亡細胞百分比顯著降低(P<0.01，圖3C)。

與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中脂肪酶及淀粉酶活性顯著升高(P<0.01，圖4)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中脂肪酶及淀粉酶活性顯著降低(P<0.01，圖4)。

圖2 各組中miR-30a-5p的mRNA水平

注：A.胰腺泡細胞損傷對miR-30a-5p的影響；B.miR-30a-5p mimic對miR-30a-5p的影響。與Control組比較，**P<0.01；與miR-30a-5p

mimic group組比較，##P<0.01

2.4 胰腺泡細胞損傷及miR-30a-5p mimic對炎癥反應和細胞自噬的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著升高(P<0.01)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著降低(P<0.01)。見圖5。

與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1的表達顯著上升，p62的表達顯著下降(P<0.01)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1的表達顯著下降，p62的表達顯著上升(P<0.01)。見圖6。

圖3 各組細胞存活率及凋亡細胞百分比

注：A.Hoechst染色圖；B.各組細胞存活率；C.各組凋亡細胞百分比。與Control組比較，**P<0.01；與miR-30a-5p mimic group組比較，##P<0.01

圖4 各組細胞中的脂肪酶及淀粉酶活性

圖5 各組細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度

注：A.各組細胞中TNF-α的濃度；B.各組細胞中IL-6的濃度；C.各組細胞中IL-1β的濃度。與Control組比較，**P<0.01；與miR-30a-5p mimic group組比較，##P<0.01

圖6 各組細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1和p62的表達水平

2.5 胰腺泡細胞損傷及miR-30a-5p mimic對PI3K/AKT/mTOR的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中p-P13K、p-Akt及p-mTOR的表達顯著下降(P<0.01)。與Model組比較，mimic mock組差異無統(tǒng)計學意義；miR-30a-5p mimic組中p-P13K、p-Akt及p-mTOR的表達顯著上升(P<0.01)。見圖7。

圖7 各組細胞中p-P13K、p-Akt及p-mTOR的表達水平

2.6 miR-30a-5p和Beclin1的靶向關(guān)系 生物信息預測結(jié)果顯示，miR-30a-5p和Beclin1之間存在連續(xù)結(jié)合片段。提示兩者之間存在靶向關(guān)系。miR-30a-5p mimic可顯著降低Beclin1wt的熒光酶活性(P<0.01)，而對結(jié)合片段突變后的Beclin1mut沒有顯著影響。見圖8。

2.7 miR-30a-5p mimic及pc-Beclin1對細胞自噬、細胞存活及凋亡的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中Beclin1的表達顯著增加，LC3熒光值(綠色)顯著升高(P<0.01)。與Model組比較，miR-30a-5p mimic組中Beclin1的表達顯著減少，LC3熒光值顯著降低(P<0.01)。pc-Beclin1可顯著上調(diào)Beclin1表達(P<0.01)。與miR-30a-5p mimic組比較，pc-Beclin1+miR-30a-5p mimic(pc-Beclinl+mimic)組中Beclin1的表達顯著增加，LC3熒光值顯著升高(P<0.01)。見圖9。

圖8 miR-30a-5p和Beclin1的靶向關(guān)系

與Control組比較，Model組胰腺泡細胞存活率顯著降低(P<0.01，圖10B)，凋亡細胞百分比顯著升高(P<0.01，圖10C)。與Model組比較，miR-30a-5p mimic組細胞存活率顯著升高(P<0.01，圖10B)，凋亡細胞百分比顯著降低(P<0.01，圖10C)。與miR-30a-5p mimic組比較，pc-Beclin1+ mimic組細胞存活率顯著降低(P<0.01，圖10B)，凋亡細胞百分比顯著升高(P<0.01，圖10C)。

圖9 各組細胞中Beclin1及LC3的表達

注：A.各組細胞中Beclin1的表達；B.Beclin1表達水平量化分析；C.各組細胞中LC3的表達；D.各組LC3陽性細胞百分比。與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01；與miR-30a-5p mimic group組比較，&&P<0.01

圖10 各組細胞存活率及凋亡細胞百分比

注：A.Hoechst染色圖；B.各組細胞存活率；C.各組凋亡細胞百分比。與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01；與miR-30a-5p mimic group組比較，&&P<0.01

2.8 miR-30a-5p mimic及pc-Beclin1對脂肪酶及淀粉酶的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞中脂肪酶及淀粉酶活性顯著升高(P<0.01)。與Model組比較，miR-30a-5p mimic組脂肪酶及淀粉酶活性顯著降低(P<0.01)。與miR-30a-5p mimic組比較，pc-Beclin1+ mimic組脂肪酶及淀粉酶活性顯著升高(P<0.01)。見圖11。

2.9 miR-30a-5p mimic及pc-Beclin1對胰腺泡細胞炎癥反應的影響 與Control組比較，Model組胰腺泡細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著升高(P<0.01)。與Model組比較，miR-30a-5p mimic組中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著降低(P<0.01)。與miR-30a-5p mimic組比較，pc-Beclin1+ mimic組中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著升高(P<0.01)。見圖12。

3 討論

miR-30a是一類抗細胞自噬基因，在多種細胞中顯著抑制細胞自噬的發(fā)生[8-11]。miR-30a-5p是miR-30a的存在形式之一，可顯著抑制小細胞肺癌細胞自噬的發(fā)生[7]。而在胰腺炎中，胰腺泡細胞損傷后自噬程序被過度激活，并顯著推進胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[6]。有報道，miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)自噬效應蛋白Beclin1抑制細胞自噬的發(fā)生[7]。因此，本文通過上調(diào)miR-30a-5p，對miR-30a-5p與Beclin1在胰腺炎中的作用機制及其產(chǎn)生的影響進行了深入探究。本文首先利用不同濃度的牛膽酸鈉對胰腺泡細胞AR42J進行預實驗，確定牛膽酸鈉的最佳處理濃度為500 μmol/L。隨后利用500 μmol/L的牛膽酸鈉建立胰腺泡細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)胰腺泡細胞損傷后，miR-30a-5p的mRNA水平顯著降低。提示miR-30a-5p下調(diào)與胰腺泡細胞損傷有關(guān)。

在胰腺炎中，胰腺泡細胞存活率顯著降低，凋亡水平顯著升高，進一步推進胰腺炎病情的惡化[12]。因此，促存活抗凋亡可阻止胰腺炎的惡性發(fā)展。研究表明，在骨質(zhì)溶解模型小鼠頭骨中，上調(diào)miR-30a-5p可降低成骨細胞凋亡水平，抑制骨質(zhì)溶解的發(fā)展[13]。而在卵巢癌中，高度表達的miR-30a-5p通過下調(diào)叉頭轉(zhuǎn)錄因子1顯著提高癌細胞的存活能力[14]。本文利用miR-30a-5p mimic上調(diào)miR-30a-5p后發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p可顯著抑制胰腺泡細胞損傷引起的細胞凋亡，并提高胰腺泡細胞存活率。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30a-5p可顯著降低胰腺泡細胞損傷模型細胞中脂肪酶及淀粉酶活性。脂肪酶及淀粉酶是診斷急性胰腺炎的重要指標，發(fā)生急性胰腺炎時，其活性多超過正常值3倍以上[15]。降低脂肪酶及淀粉酶活性可改善胰腺炎大鼠的病情[16]。綜合實驗結(jié)果提示，miR-30a-5p可促進胰腺泡細胞存活，抑制細胞凋亡，降低脂肪酶及淀粉酶活性，阻止胰腺炎的惡化。

圖11 各組細胞中的脂肪酶及淀粉酶活性

圖12 各組細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度

注：A.各組細胞中TNF-α的濃度；B.各組細胞中IL-6的濃度；C.各組細胞中IL-1β的濃度。與Control組比較，**P<0.01；與Model組

比較，##P<0.01；與miR-30a-5p mimic group組比較，&&P<0.01

作為炎癥調(diào)節(jié)因子，miR-30a-5p可通過MAPK/ERK信號顯著抑制脊髓損傷誘導的炎癥反應，降低TNF-α及IL-1β的產(chǎn)生[17]。研究表明，miR-30a-5p可通過降低高溫需要A1蛋白基因的轉(zhuǎn)錄抑制胰腺泡細胞中炎癥因子的釋放[5]，通過降低IL-6受體表達干擾炎癥Th17細胞的成熟[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30a-5p可顯著降低胰腺泡細胞損傷模型細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。TNF-α、IL-6和IL-1β均為促炎性細胞因子，參與炎癥級聯(lián)反應，并進一步促進胰腺炎的發(fā)展[19]。實驗結(jié)果提示，miR-30a-5p減輕胰腺泡細胞損傷引起的炎癥反應。

自噬程序在胰腺泡細胞損傷后被過度激活，自噬效應蛋白Beclin1在胰腺炎組織中高度表達并顯著推進胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a可作為抗細胞自噬基因，在膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞、血管內(nèi)皮細胞、胃癌SGC-7901細胞及晶狀體上皮細胞中顯著抑制細胞自噬發(fā)生[8-11]。作為miR-30a的存在形式之一，miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)Beclin1，顯著抑制小細胞肺癌的細胞自噬[7]。在本研究中，miR-30a-5p可顯著降低胰腺泡細胞損傷模型細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1表達，提高p62的表達。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值是估計細胞自噬水平的一個指標，當自噬形成時，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的增加表明細胞自噬水平的提高[20]。Beclin1基因又稱BECN1，可調(diào)節(jié)自噬前體的形成，誘導自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜上，促進細胞自噬的發(fā)生[21]。p62是自噬特異性底物，可與LC3相互作用，通過自噬-溶酶體通路被不斷降解，p62的聚集和增加表示細胞自噬能力的降低[22]。同時，本文通過生物信息預測及熒光素酶實驗證實，在胰腺泡細胞中，miR-30a-5p與Beclin1存在靶向關(guān)系。進一步利用pcDNA Beclin1上調(diào)Beclin1后發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p mimic對胰腺泡細胞損傷模型細胞自噬的抑制作用顯著減弱，LC3表達顯著增加。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與miR-30a-5p mimic組比較，pc-Beclin1+ mimic組中胰腺泡細胞存活率顯著降低，凋亡細胞百分比、脂肪酶及淀粉酶活性顯著升高，胰腺泡細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著增加。綜合實驗結(jié)果表明，上調(diào)Beclin1可顯著促進胰腺泡細胞自噬的發(fā)生，并抑制細胞存活，促進細胞凋亡，提高胰腺泡細胞中脂肪酶及淀粉酶活性，推進胰腺炎炎癥反應的發(fā)展。提示miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)Beclin1抑制胰腺泡細胞自噬的發(fā)生，并促進細胞存活，抑制細胞凋亡，降低胰腺泡細胞中脂肪酶及淀粉酶活性，阻礙胰腺炎炎癥反應的發(fā)展。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是經(jīng)典的促增殖抗凋亡通路，而近期研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路與細胞自噬密切相關(guān)[23-24]。在慢性胰腺炎中，PI3K/AKT/mTOR信號通路激活后，可通過抑制細胞自噬，阻礙胰腺星形細胞活化，從而阻止胰腺組織纖維化的發(fā)生[23]。在豬腎上皮細胞中，赭曲霉毒素A可通過阻礙AKT/mTOR信號通路誘導細胞自噬[24]。有報道，在心肌細胞中，miR-30a-3p可通過激活PI3K/AKT信號通路，抑制敗血癥引起的細胞凋亡。本文中，miR-30a-5p可顯著提高胰腺泡細胞損傷模型細胞中p-P13K、p-Akt及p-mTOR的表達，提示miR-30a-5p可能通過激活胰腺泡細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路，發(fā)揮促增殖抗凋亡及抑制細胞自噬的作用。

綜上所述，miR-30a-5p可激活胰腺泡細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路，提示miR-30a-5p可能通過此機制發(fā)揮促增殖抗凋亡及抑制細胞自噬的作用。同時，miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)Beclin1抑制胰腺泡細胞自噬的發(fā)生，并提高細胞存活率，降低凋亡細胞百分比及胰腺泡細胞中的脂肪酶和淀粉酶活性，阻礙炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，從而減輕牛膽酸鈉誘導的胰腺泡細胞損傷，為miR-30a-5p臨床治療胰腺炎的應用提供理論基礎(chǔ)。