郜懷峰，彭福田，肖元松，張亞飛，王國棟，孫希武，賀 月

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

低溫作為一種非常重要的非生物脅迫因子，能夠影響農(nóng)作物的生長、產(chǎn)量和地域分布等[1]。鉬是高等植物正常生長發(fā)育和生理代謝的必需微量元素之一，研究表明，鉬可以影響小麥等植物的生理代謝過程[2-3]，提高植物抗逆性。近年來，由于氣候變化異常，極端天氣時(shí)有發(fā)生。倒春寒使桃樹在生長期遭遇0℃以下低溫而使細(xì)胞組織受傷害，是一種生理病害，會(huì)對(duì)桃樹枝梢幼葉造成很大傷害，影響葉片正常的生長發(fā)育和生理功能，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如何降低低溫傷害是影響桃樹生產(chǎn)的重要因素。目前，對(duì)桃樹低溫冷害的研究只停留在田間自然條件下的低溫對(duì)果實(shí)外形及產(chǎn)量的影響方面[4]，對(duì)其生理生化指標(biāo)的研究鮮見報(bào)道。因此，加強(qiáng)鉬對(duì)桃樹低溫脅迫傷害的緩解效果及機(jī)制研究顯得尤為重要。

鉬能通過含鉬酶調(diào)控植物體內(nèi)的碳代謝、氮代謝、激素代謝和活性氧代謝等多種生理過程，與植物的抗非生物脅迫如低溫[5]、干旱[6]、鹽害[7]等密切相關(guān)。鉬不僅能夠通過含鉬酶調(diào)控ABA和IAA的合成，還能調(diào)節(jié)鉬酶活性[8]、抗氧化酶活性[9]及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[10]從而影響植物的抗性。它還對(duì)維持葉綠素結(jié)構(gòu)必不可少，缺鉬會(huì)使植物葉綠素含量明顯減少，結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，光合速率降低。鉬單獨(dú)存在于生物體時(shí)并不能發(fā)揮作用，只有形成鉬輔因子 (molybdenum cofactor，Moco) 結(jié)合到鉬酶上才具有生物活性[11-13]。在擬南芥中LOS5/ABA3是編碼鉬輔因子硫化酶的基因，該酶催化Moco硫酸化形式的產(chǎn)生，它是植物中ABA生物合成途徑最后一步起關(guān)鍵作用的醛氧化酶 (AO) 所必需的輔助因子[14]。由于AO家族具有廣泛的底物特異性，推測AO不僅調(diào)控激素合成，還參與除植物激素合成外的其他代謝活動(dòng)，研究表明，植物體內(nèi)AO不僅可以催化H2O2產(chǎn)生，還能催化的產(chǎn)生，從而影響植物活性氧代謝[15]。

前人研究表明，缺鉬條件下施鉬能提高小麥[8]、早熟禾[16]、草坪[17]等植物的抗凍性。低溫脅迫下，施鉬提高了小麥和草坪草海濱雀稗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT) 活性，增加了小麥抗壞血酸 (ASA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素 (CAR) 含量，降低了活性氧自由基的含量[8,17-18]，提高了植物清除活性氧的能力，減小了活性氧對(duì)細(xì)胞的傷害。施鉬能夠增加冬小麥可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸含量，且脯氨酸比可溶性蛋白和可溶性糖能更早、更敏感、更顯著地響應(yīng)低溫脅迫[3]。但鉬能否提高桃樹抗凍性、緩解低溫脅迫造成的傷害，至今未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以毛桃實(shí)生苗為試材，研究低溫脅迫下，鉬酸銨對(duì)桃葉片細(xì)胞膜氧化傷害、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗凍相關(guān)基因鉬輔因子硫化酶、脯氨酸合成酶及過氧化物酶表達(dá)的影響，明確鉬對(duì)桃樹低溫脅迫傷害的緩解效果及機(jī)制，以期為生產(chǎn)中緩解桃樹低溫脅迫傷害提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以當(dāng)年生毛桃 (Amygdalus persicaL.) 實(shí)生苗為試材，于2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)站進(jìn)行。

選取長勢一致、無病蟲害的20片葉毛桃實(shí)生苗定植于盆中，每盆定植1株，盆為圓柱形，內(nèi)徑10 cm、高8 cm，盆內(nèi)栽培基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石，按1∶1比例混合，基質(zhì)基本理化性狀為pH 6.81、有機(jī)質(zhì)37.64 g/kg、速效氮162.34 mg/kg、速效磷123.73 mg/kg、速效鉀140.36 mg/kg，土壤鉬含量為0.43 mg/kg (低于土壤平均水平1.7 mg/kg)，有效鉬含量為0.104 mg/kg (處于臨界水平，低于0.1 mg/kg為缺鉬水平)，每盆基質(zhì)重量為1.5 kg。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理為：清水 (M0)；0.01%鉬酸銨 (M1)；0.04%鉬酸銨(M2)；0.08%鉬酸銨 (M3)；0.12%鉬酸銨 (M4)。每個(gè)處理設(shè)9個(gè)重復(fù)。每隔5天噴施一次，每次噴50 mL，一共噴3次。第3次后，將實(shí)生苗置于冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中進(jìn)行低溫脅迫處理，于0 h、12 h、24 h、48 h測定其電導(dǎo)率，48 h后測定葉片鉬含量、凍害指數(shù)、相對(duì)電導(dǎo)率、SPAD值、凈光合速率、脯氨酸、可溶性糖等，選取最佳噴施鉬酸銨濃度。

為進(jìn)一步研究鉬酸銨對(duì)桃實(shí)生苗低溫脅迫的緩解作用及其機(jī)制，根據(jù)上一試驗(yàn)分析結(jié)果，研究0.04%鉬酸銨對(duì)桃低溫脅迫下，葉片可溶性糖、脯氨酸及抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響。選取另一批長勢一致、無病蟲害的20片葉毛桃實(shí)生苗進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：清水 + 常溫 (CK)；清水 + 0℃ (T1)；0.04%鉬酸銨 + 常溫 (T2)；0.04%鉬酸銨 + 0℃(T3)。各處理選9株長勢基本一致的實(shí)生苗，每隔5天噴施一次，每次50 mL，一共噴施3次。第3次處理后，將T1、T3置于冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中，CK、T2置于冷光源植物生長箱 (20℃，5000 lx，12 h光照)，分別于0 h、24 h、48 h取相同葉位功能葉片測定可溶性糖、脯氨酸、抗氧化酶活性和丙二醛含量，部分樣品液氮速凍，-80℃保存，測定LOS5/ABA3、P5CS1及RCI3表達(dá)量。

1.2 指標(biāo)測定

1.2.1 桃實(shí)生苗葉片鉬含量測定 參照Wang等[19]方法進(jìn)行，稱取桃實(shí)生苗葉片干樣0.3 g于消解管中，加入5 mL優(yōu)級(jí)純濃硝酸浸泡過夜后，再加入2 mL優(yōu)級(jí)純雙氧水，采用微波消解萃取儀進(jìn)行消解，消解完全冷卻后轉(zhuǎn)移至比色管中，用超純水定容至50 mL，放置過夜即可得樣品待測液。采用相同消解方法制備空白對(duì)照組，用Nex ION 300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鉬含量。每處理3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值 (下同)。

1.2.2 凍害指數(shù) 低溫脅迫后，統(tǒng)計(jì)葉片的傷害情況。只要葉片上出現(xiàn)萎蔫、水漬狀、失綠等癥狀，均認(rèn)為發(fā)生凍害。統(tǒng)計(jì)該植株發(fā)生凍害的葉片數(shù)以及植株總?cè)~片數(shù)。

凍害指數(shù) (%) = 植株上表現(xiàn)出凍害癥狀的葉片數(shù)/植株葉片總數(shù) × 100。

1.2.3 電導(dǎo)率 相對(duì)電導(dǎo)率按照李合生[20]的方法進(jìn)行。鮮樣先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗2次，避開主脈將葉片切割成大小一致的葉塊，混合均勻，取0.5 g，裝入大試管中，加入20 mL蒸餾水，抽氣3次，每次20 min，第一次抽氣后取出搖動(dòng)，室溫保持3～4 h，多次搖動(dòng)，測電導(dǎo)率S1，封口沸水浴10 min，冷卻，平衡10 min后測電導(dǎo)率S2，同時(shí)測定蒸餾水電導(dǎo)率S0。

相對(duì)電導(dǎo)率 (%) = 100 × (S1 - S0)/(S2 - S0)。

1.2.4 葉綠素SPAD值、凈光合速率 在冷光源植物生長箱內(nèi)利用CIRAS-3便攜式光合儀測定系統(tǒng)(PPSystems，英國) 測定充分展開的功能葉片凈光合速率，重復(fù)6次，取其平均值。SPAD值用SPAD-502型儀器測定，重復(fù)6次，取其平均值。

1.2.5 脯氨酸 脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[21]。稱取鮮樣0.5 g，加入5 mL磺基水楊酸，封口沸水浴10 min，冷卻，用濾紙漏斗過濾，吸濾液2 mL(對(duì)照吸蒸餾水2 mL)，加入2 mL冰乙酸，再加入3 mL酸性水合茚三酮顯色液，沸水浴40 min，冷卻，加入5 mL甲苯，充分震蕩，靜置分層，取上層甲苯液于520 nm下比色。計(jì)算公式：脯氨酸 (μg/g，F(xiàn)W或DW) = Y × V/a × W (Y由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得，V為提取液體積，a為測定時(shí)吸取的體積，W為樣品重)。

1.2.6 可溶性糖 可溶性糖采用蒽酮比色法測定。葉片擦凈，剪碎，稱取0.3 g，放入刻度試管，加10 mL蒸餾水，封口，于沸水中提取30 min (提取兩次)，提取液過濾入25 mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度。吸?.5 mL樣品液于20 mL試管中，加入蒸餾水1.5 mL，然后按順序向試管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，充分震蕩，立即將試管放入沸水中，逐管準(zhǔn)確保溫1 min，取出自然冷卻至室溫，以空白做參比，在630 nm下比色。

1.2.7 過氧化氫酶 (CAT)、丙二醛 (MDA)、過氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性測定方法

CAT活性測定采用紫外吸收法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸 (TBA) 比色法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法；SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒 (北京愛德萊生物科技有限公司) 提取樣品RNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的cDNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Perfect Real Time，TaKaRa) 獲得。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green PCR Premix Ex Taq (寶生物公司)，操作參照說明書進(jìn)行，引物參見表1。用CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，USA) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，40次循環(huán)。所有實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用進(jìn)行計(jì)算。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行圖表繪制，用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著差異性檢驗(yàn) (Duncan’s新復(fù)極差法，P〈 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗生長狀況

對(duì)不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗在冷光源植物生長箱 (0℃，5000 lx，12 h光照) 中培養(yǎng)48 h后，對(duì)各組的生長狀況進(jìn)行觀察分析。各處理的桃實(shí)生苗葉片發(fā)生不同程度的萎蔫和卷曲，其中，M0處理最為嚴(yán)重，葉片卷曲、萎蔫程度最重，0.04%鉬酸銨處理葉片萎蔫數(shù)量最少，但葉片也有卷曲現(xiàn)象。由此可知，鉬酸銨處理可以減輕低溫脅迫下桃實(shí)生苗葉片的萎蔫程度，以0.04%鉬酸銨處理效果最佳 (圖 1)。

2.2 不同濃度鉬酸銨對(duì)低溫脅迫下桃實(shí)生苗葉片凍害指數(shù)的影響

低溫脅迫下，桃實(shí)生苗葉片會(huì)受到不同程度的損傷，出現(xiàn)萎蔫、水漬狀、失綠等癥狀，對(duì)葉片的生理功能造成一定影響 (圖1)。在低溫脅迫后，對(duì)5個(gè)處理的葉片凍害指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表2可知，相對(duì)于M0 (清水) 處理，鉬酸銨處理能顯著降低葉片受凍指數(shù)，減輕葉片萎蔫程度，M1、M2、M3、M4處理凍害指數(shù)分別降低了23.8%、38.4%、29.6%、24.0%，以0.04%鉬酸銨 (M2) 處理效果最佳，與其他處理差異顯著 (P〈 0.05)。

2.3 不同濃度鉬酸銨對(duì)桃實(shí)生苗葉片鉬含量的影響

對(duì)不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片鉬含量進(jìn)行測定。與對(duì)照相比，噴施鉬酸銨顯著提高了葉片鉬含量，濃度為0.01%、0.04%、0.08%、0.12%的鉬酸銨處理分別是M0處理的2.04倍、3.33倍、4.25倍和4.45倍，差異顯著?？梢?，桃實(shí)生苗葉片鉬含量隨著噴施鉬酸銨濃度的增加而升高 (圖2)

圖1 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗生長狀況Fig. 1 Peach seedlings treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

表2 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片凍害指數(shù)Table 2 Frost index of peach seedlings treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

2.4 不同濃度鉬酸銨對(duì)低溫脅迫下桃實(shí)生苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率是衡量桃樹植株細(xì)胞內(nèi)容物擴(kuò)散到細(xì)胞外的一項(xiàng)生理指標(biāo)，能夠反映細(xì)胞質(zhì)膜受傷害的程度。低溫脅迫下，桃實(shí)生苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率隨脅迫時(shí)間呈明顯上升的趨勢，噴施不同濃度的鉬酸銨能顯著降低桃實(shí)生苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。0℃條件下，桃實(shí)生苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率在0～48 h均呈上升趨勢，噴施清水處理 (M0) 的相對(duì)電導(dǎo)率一直處于最高的水平，0.01%、0.04%、0.08%和0.12%鉬酸銨處理都能顯著降低桃實(shí)生苗的相對(duì)電導(dǎo)率，其中以M2處理效果最為顯著 (P〈 0.05)，相對(duì)電導(dǎo)率的增長幅度顯著降低，在48 h時(shí)，分別比對(duì)照降低了5.10%、7.19%、3.77%、5.03%。說明鉬酸銨處理顯著降低了桃實(shí)生苗葉片膜蛋白受傷害的程度，減少了胞質(zhì)的胞液外滲，有效地保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)，增強(qiáng)了葉片的抗低溫能力 (圖3)。

2.5 不同濃度鉬酸銨對(duì)低溫脅迫下桃實(shí)生苗葉片SPAD值、凈光合速率的影響

低溫脅迫處理后，對(duì)5組桃實(shí)生苗葉片的SPAD值和凈光合速率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同濃度鉬酸銨處理有效阻止了SPAD值及凈光合速率的降低，與M0處理相比，SPAD值分別提高了8.6%、23.4%、11.1%、8.6%；凈光合速率分別提高了9.4%、62.4%、37.6%、25.6% (圖4)，其中0.04%鉬酸銨處理效果最為明顯 (P〈 0.05)，說明0.04%處理能顯著降低低溫脅迫對(duì)桃實(shí)生苗葉片光合特性的影響。

圖2 不同濃度鉬酸銨處理桃實(shí)生苗葉片鉬含量Fig. 2 Mo contents in peach seedling leaves under various ammonium molybdate concentrations

圖3 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Fig. 3 The relative conductivity of peach seedlings leaves treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

圖4 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理桃實(shí)生苗葉片SPAD值及凈光合速率Fig. 4 SPAD values and net photosynthetic rates of peach seedling leaves treated with different concentrationsof ammonium molybdate under low temperature stress

2.6 不同濃度鉬酸銨對(duì)低溫脅迫下桃實(shí)生苗葉片脯氨酸、可溶性糖含量的影響

低溫脅迫條件下，與M0處理相比，0.01%、0.04%、0.08%和0.12%鉬酸銨處理的葉片脯氨酸含量分別提高了0.89%、11.7%、8.54%、5.06%；可溶性糖含量分別提高了1.95%、9.64%、6.73%、4.50%(圖5)，其中以0.04%鉬酸銨處理效果最為明顯 (P〈0.05)。脯氨酸和可溶性糖含量與溫度變化密切關(guān)聯(lián)，其含量提高能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的抗逆能力，說明鉬酸銨處理能起到調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞滲透壓、保護(hù)膜穩(wěn)定性的作用。綜上表明，0.04%鉬酸銨處理對(duì)緩解低溫脅迫傷害的效果最佳。

2.7 不同溫度下鉬酸銨對(duì)桃實(shí)生苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。低溫脅迫下，桃實(shí)生苗葉片的可溶性糖和脯氨酸含量較常溫條件下呈升高趨勢，0.04%鉬酸銨處理能顯著提高葉片可溶性糖和脯氨酸含量 (P〈 0.05)。由圖6所示，T1 (清水 + 0℃)、T3 (0.04% 鉬酸銨 + 0℃) 處理葉片的可溶性糖和脯氨酸 (圖6) 含量在0～48 h呈顯著上升趨勢。在24 h時(shí)，T3處理較T1處理可溶性糖含量無顯著差異，脯氨酸含量提高了8.82%；在48 h時(shí)，T3處理較T1處理可溶性糖含量提高了8.27%，脯氨酸含量提高了8.69%；CK (清水 + 常溫)、T2 (0.04%鉬酸銨 + 常溫) 處理沒有明顯變化?？扇苄蕴呛透彼崮軌蛎舾?、顯著地響應(yīng)低溫脅迫，0.04%鉬酸銨處理使其含量升高可提高細(xì)胞滲透勢，有利于維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，是植物對(duì)逆境條件的一種適應(yīng)性變化。

圖5 低溫脅迫下不同濃度鉬酸銨處理桃實(shí)生苗葉片的脯氨酸和可溶性糖含量Fig. 5 Proline and soluble sugar contents of peach seedling leaves treated with different concentrations of ammonium molybdate under low temperature stress

圖6 不同溫度下鉬酸銨對(duì)桃實(shí)生苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響Fig. 6 Effect of ammonium molybdate on soluble sugar and proline contents of peach seedling leaves under different temperatures

2.8 鉬酸銨對(duì)葉片丙二醛含量及保護(hù)酶活性的影響

丙二醛積累量是反映膜脂過氧化作用和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度的一個(gè)重要指標(biāo)，過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶是防止氧自由基對(duì)細(xì)胞膜傷害的關(guān)鍵酶，對(duì)清除低溫下自由基傷害起重要作用。試驗(yàn)結(jié)果 (圖7)表明，0.04%鉬酸銨處理能顯著

(P〈 0.05) 降低低溫 (0℃) 脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)MDA的積累量，提高CAT、POD、SOD活性。在24 h時(shí)，T3處理MDA含量比T1處理降低了14.6%，CAT、POD、SOD活性分別提高了1.78%、18.7%、5.24%；48 h時(shí)，T3處理MDA含量比T1處理降低了10.8%，CAT、POD、SOD活性分別提高了1.98%、11.8%、9.15%，差異顯著 (P〈 0.05)。

2.9 鉬酸銨對(duì)LOS5/ABA3表達(dá)量的影響

0.04%鉬酸銨處理能顯著提高低溫脅迫下LOS5/ABA3的表達(dá)量。在試驗(yàn)24 h時(shí)，T1、T3處理表達(dá)量分別提高了1.16倍、2.76倍，T3比T1提高了2.38倍；48 h時(shí)，T1表達(dá)量降低為0.49倍，T3處理仍提高了2.54倍。相對(duì)于T1處理，T3處理后，LOS5/ABA3的表達(dá)量保持在穩(wěn)定且顯著較高的水平 (圖 8)。

2.10 鉬酸銨對(duì)P5CS1和RCI3表達(dá)量的影響

低溫脅迫下，P5CS1和RCI3表達(dá)量呈顯著上升趨勢，0.04%鉬酸銨處理能進(jìn)一步提高P5CS1和CIR1表達(dá)量。低溫處理24 h時(shí)，T1、T3處理的P5CS1表達(dá)量分別提高了2.46倍、2.64倍，T3處理比T1處理提高了7.32%；T1、T3處理的RCI3表達(dá)量分別提高了1.39倍、1.50倍，T3處理比T1處理提高了7.91%。處理48 h時(shí)，T1、T3處理的P5CS1表達(dá)量分別提高了1.15倍、2.29倍，T3處理是T1處理的1.99倍；T1、T3處理的RCI3表達(dá)量分別提高了1.20倍、1.66倍，T3處理比T1處理提高了 38.3%，差異顯著 (P〈 0.05) (圖 9)。

圖7 鉬酸銨處理后不同時(shí)間丙二醛含量和過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性Fig. 7 MDA content and activities of CAT, POD and SOD after treatment of ammonium molybdate

3 討論

鉬為植物必需微量元素，在提高植物抗逆性中具有重要作用，在酸性缺鉬土壤中施用鉬肥對(duì)冬小麥具有防凍作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)低鉬土壤生長的毛桃實(shí)生苗進(jìn)行噴鉬處理可顯著增加葉片鉬含量，緩解低溫脅迫下葉片萎蔫程度，有效緩解葉綠素含量和光合速率的降低。但抗凍效果并沒有隨施鉬量的增加而逐漸增強(qiáng)，這可能是因?yàn)楹侠頋舛鹊你f供應(yīng)有利于提高植物體內(nèi)養(yǎng)分的吸收與征調(diào)能力及酶活性，鉬含量過高則會(huì)打破植物體內(nèi)鉬的平衡機(jī)制[23]。

圖8 0.04%鉬酸銨處理24、48小時(shí)后LOS5/ABA3的表達(dá)量Fig. 8 Expression level of LOS5/ABA3 at 24 and 48 h after treated with 0.04% ammonium molybdate

鉬只有結(jié)合鉬輔因子后才能發(fā)揮其生物有效性，因此研究編碼鉬輔因子的基因就顯得尤為重要。LOS5/ABA3作為編碼鉬輔因子硫化酶的基因，不僅參與調(diào)控醛氧化酶 (AO) 的活性，調(diào)節(jié)激素合成，還進(jìn)一步調(diào)控植物抗氧化防御能力及其他抗寒基因的表達(dá)，是ABA生物合成、脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)和脅迫耐受的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[24-25]，植株在敲除LOS5基因后對(duì)逆境脅迫的敏感性增強(qiáng)，更加從反面證明該基因與逆境脅迫有關(guān)[16]。轉(zhuǎn)基因大豆中擬南芥LOS5/ABA3基因上調(diào)表達(dá)，提高了AO活性導(dǎo)致ABA積累顯著增加，提高了植株抗逆性[26]。

圖9 0.04%鉬酸銨處理24、48小時(shí)后P5CS1和RCI3的相對(duì)表達(dá)量Fig. 9 Relative expression of P5CS1 and RCI3 at 24 and 48 h after treated with 0.04% ammonium molybdate

本試驗(yàn)表明，0.04%鉬酸銨處理上調(diào)了LOS5/ABA3的表達(dá)，在低溫脅迫下更為顯著，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下0.04%鉬酸銨處理上調(diào)了P5CS1和RCI3的表達(dá)，同時(shí)葉片中脯氨酸含量及過氧化物酶活性與對(duì)照相比顯著提高。這可能是因?yàn)?，一些冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)受低溫脅迫的調(diào)控，同時(shí)也對(duì)水分脅迫和脫落酸 (ABA) 有響應(yīng)[27]，RCI3受到環(huán)境和內(nèi)源物質(zhì)的復(fù)雜調(diào)節(jié)[28]。LOS5 /ABA3作為ABA合成關(guān)鍵基因，它在表達(dá)上調(diào)時(shí)會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上影響RCI3的表達(dá)。1-吡咯啉-5-羧酸合成酶是脯氨酸合成過程中重要的催化酶，LOS5/ABA3能夠提高脯氨酸合成酶基因 的表達(dá)量，調(diào)控脯氨酸的合成，進(jìn)而影響植物的抗寒性[29-30]。

植物對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)會(huì)部分通過改變其基因表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和全植物水平上的各種適應(yīng)性反應(yīng)[27,31]。本試驗(yàn)表明，噴施鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片可溶性糖、脯氨酸含量顯著提高，酶活性顯著提高，與前人施鉬能夠增加冬小麥可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸的含量，提高抗氧化酶活性[3]結(jié)果相一致。這可能是因?yàn)樵诘蜏氐确巧锬婢趁{迫下，植物通過啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控抗寒基因及蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而影響植物體內(nèi)各種代謝過程，最終增強(qiáng)植物的抗逆性[5]?？梢娿f作為植物體必需微量元素，對(duì)于調(diào)節(jié)植株激素、蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸等內(nèi)源物質(zhì)含量，提高植株抗凍性具有重要意義。

凍害對(duì)植物的傷害主要是破壞細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)，從而引起代謝失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間隙的水溶液濃度比細(xì)胞液低，引起細(xì)胞內(nèi)水分外滲。前人研究表明，施用鉬肥提高冬小麥葉細(xì)胞細(xì)胞器及其膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性，有利于提高冬小麥膜脂肪酸的不飽和度，降低了膜脂的相變溫度，加強(qiáng)了膜的流動(dòng)性，增強(qiáng)了冬小麥的抗寒力[32]。

本試驗(yàn)表明，低溫脅迫下，桃實(shí)生苗葉片生理生化功能受到一定損傷，電導(dǎo)率呈上升趨勢，膜透性發(fā)生改變，但不同濃度鉬酸銨處理使桃實(shí)生苗葉片凍害指數(shù)、相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低，以0.04%濃度效果最佳。且0.04%鉬酸銨處理的MDA含量顯著降低，CAT、POD、SOD活性顯著升高，可以迅速降低桃實(shí)生苗葉片活性氧自由基含量，增強(qiáng)了植物清除活性氧的能力，降低了活性氧對(duì)植物細(xì)胞的傷害。這可能是鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片的葉綠素含量和凈光合速率下降幅度得到緩解的一個(gè)重要原因。且鉬是維持葉綠體結(jié)構(gòu)必不可少的，能提高甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAP和果糖-1, 6二磷酸酶FBPase的活性，提高了凈光合速率，促進(jìn)了光合作用的進(jìn)行[33-34]。

綜上表明，噴施鉬酸銨處理的桃實(shí)生苗葉片，鉬輔因子硫化酶、脯氨酸合成酶、過氧化物酶編碼基因表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，脯氨酸含量、可溶性糖含量、抗氧化酶活性等也顯著提高，說明鉬能通過調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而緩解低溫脅迫對(duì)桃實(shí)生苗葉片的傷害，但鉬調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫脅迫下，低鉬土壤生長的桃實(shí)生苗噴施0.04%鉬酸銨，可上調(diào)抗凍相關(guān)基因LOS5/ABA3(鉬輔因子硫化酶)、P5CS(脯氨酸合成酶) 及RCI3(過氧化物酶) 的表達(dá)量，提高葉片可溶性糖、脯氨酸含量及抗氧化酶活性，緩解低溫脅迫下葉片細(xì)胞膜氧化傷害，減輕低溫脅迫對(duì)桃實(shí)生苗的傷害。