欒會妮 ，梁 亞 ，楊 磊 ，王珊珊 ，叢文虎 ，劉振華

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院海洋生物與醫(yī)藥系，山東威海 264300；2.威海市微藻種質(zhì)資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，山東威海 264300）

角毛藻Chaetoceros是水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼體的優(yōu)質(zhì)生物餌料，其富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳四烯酸（ARA）等高度不飽和脂肪酸。但目前，大多角毛藻不耐高溫，例如旋鏈角毛藻Chaetoceros curvisetus[1]最適宜生長溫度為20℃、角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]的最適生長溫度為22.3℃以及纖細角毛藻Chaetoceros gracilis[3]最適生長溫度為20℃。在高溫季節(jié)，傳統(tǒng)的角毛藻難于高效培養(yǎng)和穩(wěn)定供應(yīng)于海膽等海洋動物的人工育苗，影響育苗效益，因此篩選適應(yīng)性強、耐高溫的角毛藻藻株對解決夏季高溫生物餌料缺乏問題具有重要意義。此外，微藻生長受到許多環(huán)境因子如光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽成分等的影響，任何一種因子的缺乏或過量都會導(dǎo)致脅迫的產(chǎn)生，從而對微藻的生長產(chǎn)生不同程度的影響[1-7]。

本研究選用威海市微藻種質(zhì)資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心提供的可在水溫高達33℃時能正常生長繁殖的角毛藻藻株作為研究對象。通過單因子實驗方法研究鹽度、溫度和光照強度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響，以期為高溫季節(jié)中間球海膽Strongylocentrotus intermedius、太平洋牡蠣Crassostrea angulata、魁蚶Scapharca broughtonii和毛蚶Scapharca subcrenata等育苗中耐高溫角毛藻藻株開發(fā)利用提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用角毛藻Chaetoceros sp.藻株屬硅藻門Bacillariophyta、中心硅藻綱Centricae、盒形藻目Biddulphiales、角毛藻科Chaetoceraceae、角毛藻屬Chaetoceros，由威海市微藻種質(zhì)資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心篩選和提供。該角毛藻藻株帶面觀呈正方形或長方形，大小(3.02～5.94)×(3.67～8.19)μm，角毛長為細胞長度的2～3倍，絕大多數(shù)為單個細胞，少數(shù)2個細胞相連成群體，老化時會分泌膠質(zhì)形成膠群體。該株角毛藻夏季高溫季節(jié)實驗室三角燒瓶內(nèi)水溫為32℃～33℃時能夠較好地生長繁殖。海水取自桑溝灣自然海區(qū)，自然海水經(jīng)24 h沉淀，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，加熱煮沸消毒并自然冷卻，用超純水稀釋的方法調(diào)配低鹽度，使用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的分析純NaCl調(diào)配高鹽度。

1.2 培養(yǎng)方法和條件

采用單因子的實驗方法，研究耐高溫角毛藻藻株的生長繁殖規(guī)律。培養(yǎng)液采用f/2營養(yǎng)配方。取指數(shù)生長期的耐高溫角毛藻藻株，接種于500 mL的三角燒瓶中，接種后培養(yǎng)液和藻液共300 mL，設(shè)3個平行樣，初始種群密度相同均為(3.19±0.00)×104個·mL-1，置于光照培養(yǎng)箱中，以日光燈為光源，光周期為12 L:12D，每天固定時間搖瓶4次。

1.2.1 鹽度對耐高溫角毛藻藻株生長影響的試驗

設(shè)置鹽度為 2.5、5、10、15、20、25、30、35，共 8 個鹽度梯度。光照強度為 3 000 lx，培養(yǎng)液溫度為 30 ℃，pH為8.2，連續(xù)測定17 d。

1.2.2 溫度對耐高溫角毛藻藻株生長影響的試驗

設(shè)置5個溫度梯度：15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，光照強度為3 000 Lxlx，培養(yǎng)液鹽度為30，pH為8.2，連續(xù)測定15 d。

1.2.3 光照強度對耐高溫角毛藻藻株生長影響的試驗

設(shè)置5個光照強度梯度：1 000 lx、3 000 lx、5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx，培養(yǎng)液溫度為 30℃，培養(yǎng)液鹽度為30，pH為8.2，連續(xù)測定15 d。

1.3 耐高溫角毛藻藻株生長檢測

每天在同一固定的時間用血球計數(shù)板法并結(jié)合分光光度法測定種群密度[6]。計算比生長率，公式[8]為：

式中：μ—比生長率，d-1；N0—培養(yǎng)初始藻細胞密度，×104個·mL-1；Nt—經(jīng)過 t時間后培養(yǎng)液中的藻細胞密度，×104個·mL-1；t—培養(yǎng)時間，d。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用 SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析并作Duncan多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。并對耐高溫角毛藻藻株的比生長率進行回歸分析，求算最適生長鹽度、溫度和光照強度及適宜生長區(qū)間[9-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

圖1為不同鹽度下耐高溫角毛藻藻株生長密度隨培養(yǎng)時間的變化趨勢。由圖1可見，初始種群密度相同，均為（3.19±0.00）×104個·mL-1，耐高溫角毛藻藻株在本研究中設(shè)置的鹽度梯度2.5～35范圍內(nèi)均能生長；總體上，隨著鹽度的增加角毛藻藻株種群密度增加。隨著培養(yǎng)時間的增加，鹽度 15、20、25、30、35 處理組均表現(xiàn)為種群密度先增加后減少的變化趨勢，其中，在第1～3 d增長緩慢，第4 d開始至第10 d增長較為迅速，從第11 d開始增長趨緩，第13 d起種群密度逐漸開始下降。鹽度2.5、5和10處理組大部分時間種群密度顯著低于其他處理組但一直呈上升趨勢。鹽度30處理組耐高溫角毛藻藻株的種群密度在第5 d、第7 d～第14 d顯著高于其他處理組（P＜0.05），其中第12 d，種群密度高達(240.71±3.34)×104個·mL-1，平均值的95%的置信區(qū)間下限、上限分別為232.41×104個·mL-1、249.01×104個·mL-1，第 13 d～第 17 d，種群密度逐漸下降，第 17 d 時其種群密度僅高于鹽度2.5、5和35處理組，而低于其他處理組。鹽度10處理組從16 d起種群密度顯著高于其他處理組（P＜0.05）。鹽度2.5和5處理組在整個實驗期間種群密度一直顯著低于其他處理組（P＜0.05）。

圖1 不同鹽度下耐高溫角毛藻藻株生長密度的變化Fig.1 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different salinities

微藻三級培養(yǎng)時為使微藻達到一定種群密度、新鮮且提高培養(yǎng)池循環(huán)利用率，一般不超過5 d，并且由圖1可以看出培養(yǎng)11 d，鹽度25、30和35處理組種群密度出現(xiàn)拐點開始下降，因此對培養(yǎng)5 d和培養(yǎng)11 d的各鹽度梯度的比生長率進行了分析。表1為不同鹽度梯度下耐高溫角毛藻藻株的比生長率。由表1可知，培養(yǎng)5 d，各組間比生長率均差異顯著（P＜0.05），其中鹽度35處理組生長最旺盛，比生長率為0.798±0.003，顯著高于其他組（P＜0.05）；對不同鹽度下耐高溫角毛藻藻株比生長率回歸分析得：y=-0.000 4 x2+0.025 3 x+0.422 3(R2=0.833 4)，由回歸方程得最適鹽度為31.6，適宜鹽度范圍為 17.3～46.0。培養(yǎng)11 d，鹽度30和35處理組種群密度開始下降，各組間比生長率均差異顯著（P＜0.05），其中鹽度30處理組生長最旺盛，比生長率為0.393±0.003，顯著高于其他組（P＜0.05）；對不同鹽度下耐高溫角毛藻比生長率回歸分析得：y=-0.000 07 x2+0.004 3 x+0.329 3(R2=0.941 3)，由回歸方程得適宜鹽度范圍為7.0～54.5，最適鹽度為30.7。

由此可見，培養(yǎng)前期即第1 d～第12 d，隨著鹽度的升高種群密度增加，高鹽處理組（鹽度35和30）生長優(yōu)于中鹽處理組（鹽度25、20和15），中鹽處理組生長優(yōu)于低鹽組（鹽度2.5、5和10）；培養(yǎng)中期階段即第13 d～第15 d，高鹽度處理組至中鹽度處理組種群密度逐一出現(xiàn)拐點并開始下降，低鹽度處理組種群密度仍呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢，鹽度30處理組種群密度從第5 d開始顯著高于其他處理組直至第14 d；培養(yǎng)后期即第16 d和第17 d鹽度10處理組生長優(yōu)于其他處理組，鹽度15～35范圍內(nèi)，隨著鹽度的降低種群密度增加，鹽度2.5和鹽度5生長仍差于其他處理組。

表1 不同鹽度下耐高溫角毛藻藻株的比生長率Tab.1 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different salinities

2.2 溫度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

圖2為15 d培養(yǎng)期內(nèi)不同溫度下耐高溫角毛藻藻株生長密度隨培養(yǎng)時間的變化情況。由圖2可見，耐高溫角毛藻藻株在水溫15～35℃范圍內(nèi)均能生長。與不同鹽度處理類似，前6 d，隨著溫度的增加，耐高溫角毛藻藻株的種群密度逐漸增加且各溫度處理組之間均存在顯著差異（P＜0.05），并且隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理間均表現(xiàn)為種群密度逐漸增加。初始種群密度均為(3.19±0.00)×104個·mL-1，在整個培育階段，各處理間又有所不同，15℃和20℃處理組種群密度均一直保持上升趨勢，至培養(yǎng)結(jié)束時種群密度分別為(168.07±2.28)×104個·mL-1和(179.44±1.90)×104個·mL-1；25 ℃和 30 ℃處理組種群數(shù)量變化接近，前14 d一直呈上升趨勢，第15 d才開始下降，第14 d的種群密度分別為 (151.85±1.59)×104個·mL-1和(145.53±1.46)×104個·mL-1；35 ℃處理組種群密度前 8 d增加，從第 9 d開始減少，第 8 d 的種群密度為(132.26±0.36)×104個·mL-1。

圖2 不同溫度下耐高溫角毛藻藻株生長密度的變化Fig.2 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different water temperature

表2為不同溫度梯度下耐高溫角毛藻藻株的比生長率。由表2可知，培養(yǎng)5 d，各處理組間比生長率差異顯著（P＜0.05），35 ℃處理組比生長率高于其他處理組（P＜0.05），其比生長率為 0.722±0.000；對不同水溫下耐高溫角毛藻藻株比生長率回歸分析得：y=-0.000 8 x2+0.051 8 x-0.131 9（R2=0.959 3），由回歸方程得最適生長水溫為32.4℃，適宜生長水溫范圍為23.0～41.8℃；培養(yǎng)11 d，25℃和30℃處理組間比生長率差異不顯著（P＞0.05），比生長率分別為0.341±0.001和0.342±0.000顯著高于35℃處理組0.318±0.001（P＜0.05）；對不同水溫下耐高溫角毛藻藻株比生長率回歸分析得：y=-0.000 2 x2+0.006 6 x+0.279 5（R2=0.884 2），由回歸方程得適宜生長水溫范圍為3.6～29.4℃，其中最適生長水溫為16.5℃。

可見，培養(yǎng)第1 d～第6 d低密度階段，隨著溫度的升高種群密度增加，高溫處理組生長優(yōu)于低溫組；培養(yǎng)中期階段即第7 d～第12 d，35℃處理組種群密度出現(xiàn)拐點并開始下降，30℃和25℃處理組種群密度仍呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢，20℃處理組種群密度從第9 d開始生長優(yōu)于其他處理組；培養(yǎng)后期即第13 d～第15 d，低溫處理組生長優(yōu)于高溫處理組。

表2 不同溫度下耐高溫角毛藻藻株的比生長率Tab.2 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different water temperature

2.3 光照強度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

圖3為不同光照強度下耐高溫角毛藻藻株生長密度隨培養(yǎng)時間的變化趨勢。由圖3可見，耐高溫角毛藻藻株在光照強度1 000～9 000 lx范圍內(nèi)均能生長。1 000 lx處理組種群密度一直呈持續(xù)增加趨勢，且在第2 d～第14 d種群密度均為最低；3 000 lx處理組種群密度呈先增加后期減少的趨勢；5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx處理組種群密度變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)前6 d種群密度持續(xù)增加，第7 d少量減少而后緩慢增加再減少的趨勢。培養(yǎng)第1 d～第4 d，各處理組隨著光照強度的增加種群密度增加，9 000 lx處理組種群密度顯著高于其他處理組；培養(yǎng)第5 d～第6 d，5 000 lx處理組種群密度最高；第7 d～第15 d，3 000 lx處理組種群密度最高。培養(yǎng)前7 d最大種群密度出現(xiàn)在5 000 lx處理組培養(yǎng)第6 d，為(168.07±1.67)×104個·mL-1，平均值的95%的置信區(qū)間下限、上限分別為163.91×104個·mL-1、172.22×104個·mL-1；后 8 d最大種群密度出現(xiàn)在3 000 lx處理組培養(yǎng)第13 d，為(197.33±0.73)個·mL-1，平均值的95%的置信區(qū)間下限、上限分別為195.52×104個·mL-1、199.15×104個·mL-1。

此外，由圖3可以看出，培養(yǎng)5 d，5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx處理組種群密度均出現(xiàn)拐點，由表3可知，培養(yǎng)5 d，1 000 lx處理組比生長率為0.513±0.005顯著小于其他處理組（P＜0.05）；3 000 lx、7 000 lx和 9 000 lx處理組間比生長率差異不顯著（P＞0.05），比生長率分別為 0.768±0.000、0.773±0.001和 0.772±0.003；5 000 lx處理組比生長率 0.793±0.002顯著高于其他處理組（P＜0.05）；對不同光照強度下耐高溫角毛藻藻株比生長率回歸分析得：y=-1×10-8x2+0.000 1 x+0.424(R2=0.885 4)，由回歸方程得最適光照強度為5 000.0 lx，適宜光照強度范圍為2 403.9～7 596.2 lx。培養(yǎng)11 d，1 000 lx處理組比生長率為 0.343±0.002顯著小于其他處理組（P＜0.05）；3 000 lx和 5 000 lx處理組比生長率顯著高于其他處理組（P＜0.05）；對不同光照強度下耐高溫角毛藻藻株比生長率回歸分析得：y=-1×10-9x2+0.000 01 x+0.334 6(R2=0.758)，由回歸方程得最適光照強度為5 000.0 lx，適宜光照強度范圍為996.7～10 996.7 lx。

圖3 不同光照強度下耐高溫角毛藻藻株生長密度的變化Fig.3 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different light intensities

可見，培養(yǎng)前期即第1 d～第4 d低密度階段，隨著光照強度的增加種群密度增加，高光照強度處理組生長優(yōu)于低光照強度處理組；培養(yǎng)中期即第5 d～第6 d，5 000 lx處理組生長優(yōu)于其他處理組；培養(yǎng)后期即第7 d～第15 d，3 000 lx處理組生長優(yōu)于其他處理組；1 000 lx處理組在培養(yǎng)的大部分時間里生長顯著差于其他處理組（P＜0.05）。

表3 不同光照強度下耐高溫角毛藻藻株的比生長率Tab.3 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different light intensities

3 討論

3.1 鹽度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

鹽度是影響微藻生長的一個重要環(huán)境因子，鹽度從滲透壓、營養(yǎng)鹽吸收及懸浮性等方面影響硅藻生長[13]。該耐高溫角毛藻藻株在試驗設(shè)計的鹽度2.5～35的范圍內(nèi)均可以生長繁殖，從鹽度的適應(yīng)能力看，為廣鹽種。隨著鹽度的增加耐高溫角毛藻藻株種群密度增加，并且由鹽度和比生長率回歸方程得出其適宜鹽度范圍為17.3～46.0，最適鹽度為31.6，其最適鹽度高于茅華等[1]報道的旋鏈角毛藻Chaetoceros curvisetus（最適鹽度25）、曾蓓蓓等[2]從上海奉賢一處半咸水池塘分離角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98（(最適鹽度12.6）)以及張平等[7]報道的牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri（最適鹽度21.0），由此可見，該耐高溫角毛藻藻株對高鹽適應(yīng)能力強。試驗用耐高溫角毛藻藻株雖然可以在鹽度2.5和5的條件下生長繁殖，但比生長率低，生長緩慢，并且鹽度2.5和鹽度5均低于由培養(yǎng)5 d不同鹽度下比生長率回歸分析得適宜鹽度范圍17.3～46.0和培養(yǎng)11 d不同鹽度下比生長率回歸分析得適宜鹽度范圍7.0～54.5，當(dāng)鹽度低于其適宜的范圍，會影響微藻細胞的滲透壓，降低了其對營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力，從而抑制了生長[14]。該耐高溫角毛藻藻株雖為廣鹽種，對高鹽度的適應(yīng)能力強，但鹽度5以下生長受到明顯抑制。

3.2 溫度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

溫度是影響微藻生長的一個重要環(huán)境因子，不同微藻適宜的溫度范圍不同[9]。該耐高溫角毛藻藻株在試驗設(shè)計的15～35℃的范圍內(nèi)均可以生長繁殖，從對溫度的適應(yīng)能力看，為廣溫種。培養(yǎng)前期隨著溫度的升高種群密度增加，35℃處理組和30℃處理組生長顯著優(yōu)于其他處理組；由溫度和比生長率回歸方程得出其適宜生長溫度為23.0～41.8℃，最適溫度為32.4℃，其最適溫度與RENAUD，et al[15]報道的澳大利亞熱帶地區(qū)角毛藻的適宜溫度33～35℃接近，遠高于旋鏈角毛藻Chaetoceros curvisetus[1]最適宜生長溫度20℃、角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]的最適生長溫度22.3℃以及蒙天[3]報道的纖細角毛藻Chaetoceros gracilis最適生長溫度20℃，由此可見該耐高溫角毛藻藻株對高溫適應(yīng)能力強。35℃高溫處理組在第9 d種群密度開始下降，主要原因是該處理組在第1 d～第8 d藻細胞繁殖最快，消耗了大量的營養(yǎng)鹽。35℃處理組在培養(yǎng)第9 d開始進入死亡期，30℃和25℃和處理組在第15 d開始進入死亡期，20℃和15℃處理組在試驗結(jié)束時仍處于相對生長下降期，因為溫度不僅能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)酶的活性[16]而且還影響細胞分裂周期及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[17]。培養(yǎng)5 d比生長率回歸方程和培養(yǎng)11 d比生長率回歸方程得出的最適溫度差異顯著，也說明了溫度變化能夠顯著影響耐高溫角毛藻藻株的生長周期，這一點與茅華[1]的研究結(jié)論一致。15℃處理組在培養(yǎng)第2 d～第9 d種群密度顯著低于其他處理組(P＜0.05)表明該耐高溫角毛藻藻株在15℃以下生長緩慢。該耐高溫角毛藻藻株為廣溫種，對高溫的適應(yīng)能力強，但溫度15℃以下生長緩慢。

3.3 光照強度對耐高溫角毛藻藻株生長的影響

光照強度是影響微藻生長的一個重要環(huán)境因子，光照既可以通過一系列鐵氧還原蛋白和硫氧還原蛋白參與信號傳導(dǎo)，激活質(zhì)體中的乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）[18]還決定著硅藻光合作用效率對藻類的生長速率起著重要的作用[19]。該耐高溫角毛藻藻株在試驗設(shè)計的1 000～9 000 lx的范圍內(nèi)均可以生長繁殖，從對光照強度的適應(yīng)能力看，試驗用藻株對光照強度的適應(yīng)范圍寬。由光照強度和比生長率回歸方程得該耐高溫角毛藻藻株適宜光照強度范圍為 2 403.9～7 596.2 lx，最適光照強度為 5 000.0 lx（90 μmol·m-2·s-1），其最適光照強度高于角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]最適光照強度28 μmol·m-2·s-1，遠低于牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri[3]最適光照強度200 μmol·m-2·s-1和纖細角毛藻Chaetoceros gracilis[3]（Chaetoceros gracilis）250 μmol·m-2·s-1。浮游植物的生長速率隨著光照強度從0到某一個最適光照強度的增加而相應(yīng)地增加[20]，本研究結(jié)果也反映了這一規(guī)律。但光照強度太強，會導(dǎo)致光合色素的光氧化和細胞中的某些酶受到氧化傷害而使光合作用速率下降[21]，7 000 lx和9 000 lx處理組在培養(yǎng)后期表現(xiàn)得尤為明顯。1 000 lx處理組在培養(yǎng)第2 d～第13 d種群密度顯著低于其他處理組(P＜0.05)表明該耐高溫角毛藻藻株在1 000 lx以下生長受到明顯抑制。該耐高溫角毛藻藻株為廣光照種，但光照強度1 000 lx以下時生長緩慢。

4 結(jié)論

不同鹽度、溫度和光照強度對耐高溫角毛藻藻株生長均有顯著影響（P＜0.05）。本研究中所選用的耐高溫角毛藻藻株適宜鹽度范圍為17.3～46.0，其中最適鹽度為31.6，當(dāng)鹽度低于5時生長受到明顯抑制。耐高溫角毛藻藻株適宜溫度范圍為23.0～41.8℃，最適溫度為32.4℃，當(dāng)溫度低于15℃時生長緩慢。耐高溫角毛藻藻株適宜光照強度范圍為2 403.9～7 596.2 lx，其中最適光照強度為5 000.0 lx，當(dāng)光照強度低于1 000 lx時生長受到明顯抑制。耐高溫角毛藻藻株具有可適應(yīng)廣溫、廣鹽和廣光照的特性，并且耐高溫、高鹽，具有很好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。