(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421000；2.益陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 益陽 413000)

目前，腦卒中已成為全世界第二位死亡原因及主要致殘疾原因，缺血性腦卒中是最主要的類型[1]。目前有效治療方法有靜脈溶栓、血管內(nèi)治療及卒中單元中的常規(guī)管理方法，但受時(shí)間窗限制，只有少部分病人能得到有效救治。因此，探尋安全、高效新療法成為目前腦卒中治療研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)證據(jù)表明，干細(xì)胞移植可以作為一種替代傳統(tǒng)藥物的腦卒中治療方法，而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其獨(dú)特分化及衍生能力，成為干細(xì)胞移植治療的首選細(xì)胞。最新研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌機(jī)制可能是MSCs細(xì)胞移植治療腦卒中最重要的作用機(jī)制。在MSCs的眾多衍生分泌物中，外泌體(exosomes)已經(jīng)引起了人們廣泛的研究興趣。研究發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體可以穿透血腦屏障到達(dá)大腦受損部位，且內(nèi)含的多種生物因子可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)及血管重塑[2]?；谠偕t(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，外泌體因其在體內(nèi)存在的廣泛性及獲取的便捷性等特性，已成為許多疾病診斷治療的可能方式，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)及再生醫(yī)學(xué)均具有廣大前景。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體概述

MSCs能夠分泌多種均勻大小的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，包括外泌體和微泡(microvesicles,MV)，這些EVs均攜帶有獨(dú)特的膜脂質(zhì)結(jié)合配體、蛋白質(zhì)及RNAs。并且參與細(xì)胞之間傳遞、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及在體內(nèi)通過短距離或長(zhǎng)距離遷移來改變細(xì)胞或組織代謝，影響細(xì)胞或組織對(duì)損傷、感染和疾病的應(yīng)激反應(yīng)[3]。在過去10年中，外泌體已成為細(xì)胞間信息傳導(dǎo)的重要媒介，其在腫瘤、感染性疾病及神經(jīng)變性疾病等多種疾病中的生理病理作用被廣泛研究。通過基因修飾工程修飾外泌體的內(nèi)含生物信息，挖掘治療干預(yù)疾病的潛在新靶點(diǎn)以及大分子藥物新型定向傳遞方式已成為如今外泌體領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

MSCs衍生的外泌體是一種大小約為30～100 nm脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，具備類似于MSCs的許多特性，攜帶有多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、脂質(zhì)信號(hào)、mRNA和調(diào)節(jié)miRNA，在組織愈合、炎癥、免疫調(diào)節(jié)及抑制纖維化等過程中發(fā)揮效應(yīng)[4]。目前，與已知產(chǎn)生外泌體的其他細(xì)胞相比，MSCs是外泌體相對(duì)衍生量最多的一類細(xì)胞。且永生化MSCs不影響所分泌外泌體的質(zhì)量與數(shù)量[5]。MSCs源性外泌體因其與來源細(xì)胞的相似生物功能特性及良好的生物相容性，在無細(xì)胞治療再生醫(yī)學(xué)方面及藥物治療載體方面有著巨大優(yōu)勢(shì)。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體的分離與提取

MSCs源性外泌體的分離與提取通常在實(shí)驗(yàn)室條件下完成，對(duì)于目前外泌體提取的方法學(xué)研究也一直是外泌體領(lǐng)域的重點(diǎn)。MSCs源性外泌體的提取方式與其他細(xì)胞來源外泌體提取方式類似，分為傳統(tǒng)的高通量方法，如超速離心法、梯度離心法、共沉淀法、尺寸排阻色譜、場(chǎng)流分級(jí)法；較為新穎方法有微流控法、非接觸法、免疫吸附法[6]。由于外泌體與其他MV有著類似結(jié)構(gòu)、密度及其他生物物理學(xué)特性，為獲得純度更高的外泌體，目前大部分較為權(quán)威外泌體實(shí)驗(yàn)研究均采用超速離心法或蔗糖密度梯度超速離心法提取外泌體。外泌體的提取與分離成本高，且產(chǎn)量較低，難以滿足一次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用量要求。因此如何簡(jiǎn)化提取分離高純度外泌體過程，是外泌體提取方法改進(jìn)的難點(diǎn)。

與永生化腫瘤細(xì)胞系不同，MSCs的擴(kuò)增能力有限，其一次外泌體產(chǎn)量難以滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需求，而MSCs源性外泌體大規(guī)模獲取仍有一定難度。有研究者用mys轉(zhuǎn)染MSCs使其永生化，而未改變MSCs外泌體產(chǎn)的數(shù)量與性質(zhì)[5]。此外，通過改變來源細(xì)胞的培養(yǎng)微環(huán)境，也能一定程度上影響外泌體的量與活性。Haraszti RA等[7]通過結(jié)合MSCs微載體的三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)及MSCs外泌體正切流動(dòng)過濾(tangential flow filtration,TFF)提取優(yōu)勢(shì)，并比較了來自2D與3D培養(yǎng)物的外泌體物理化學(xué)特性，以及由差異超速離心與TFF產(chǎn)生的外泌體的物理化學(xué)特征，結(jié)果表明，3D培養(yǎng)結(jié)合TFF可將MSCs源性外泌體的產(chǎn)量提高140倍,且這些外泌體在治療性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)移至原代神經(jīng)元的活性提高了7倍。這些高效、大量的MSCs外泌體分離提取方法將極大地促進(jìn)外泌體無細(xì)胞療法向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的可能性。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在缺血性腦卒中的應(yīng)用與機(jī)制

缺血性腦卒中后的恢復(fù)基于受損部位的神經(jīng)突觸可塑性及新血管生成，神經(jīng)突觸的可塑性是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立和維持正常信息傳導(dǎo)的核心。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，大腦皮質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列神經(jīng)突觸重塑，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞被激活，分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，參與新生血管的形成[8]，然而，大腦自我修復(fù)程度有限，不能達(dá)到臨床滿意效果。但大腦的這種自我重塑能力為使用外源性干預(yù)治療措施提供了可能性。

基于MSCs的細(xì)胞療法已經(jīng)得到廣泛研究者的證實(shí)，甚至得到了許多臨床數(shù)據(jù)的支持。盡管MSCs介導(dǎo)的修復(fù)效應(yīng)機(jī)制不完全明了，既往證據(jù)表明，MSCs可能通過線粒體轉(zhuǎn)移、旁分泌和直接分化為神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮損傷修復(fù)作用[9]。最新研究認(rèn)為，MSCs移植治療缺血性腦卒中并不需要細(xì)胞遷移至腦損區(qū)域，MSCs可能主要通過分泌攜帶有一定生物信息的外泌體來發(fā)揮內(nèi)源性修復(fù)作用。此外，在缺血性腦卒中發(fā)生后，外泌體也可在腦細(xì)胞中合成與釋放，通過血腦屏障，并且可在外周血或腦脊液中被檢測(cè)到[10]。外泌體本身不具備分化能力，且具備良好的生物相容性，幾乎不會(huì)被機(jī)體免疫機(jī)制清除。因此，基于MSCs源性外泌體移植的無細(xì)胞治療擺脫了細(xì)胞移植療法的排異性及致瘤性短板，為無細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的再生醫(yī)學(xué)帶來了一道新的曙光。見圖1。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)神經(jīng)修護(hù)

越來越多的研究表明，microRNAs是新血管生成調(diào)節(jié)的重要決定因素，也是中風(fēng)發(fā)病機(jī)制的重要因素。下調(diào)局灶性腦缺血小鼠模型中miRNA-15a(miR-15a-)能增加內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面與其受體(VEGFR-1或-2)結(jié)合可激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，并觸發(fā)促進(jìn)血管生成的多種下游信號(hào)(PI3K/Akt及MEK/ERK信號(hào)通路)[11]。Shabbir A等[12]將被PKH26標(biāo)記的三組不同劑量MSCs源性外泌體與定量人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞共孵育6 h，結(jié)果顯示MSCs源性外泌體可在體外誘導(dǎo)人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞的管狀分化，形成新生血管雛形，且新生血管形成數(shù)量及長(zhǎng)度與MSCs源性外泌體劑量相關(guān)。Chen KH等[13]的研究還表明靜脈移植脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體能明顯縮小急性缺血性卒中后梗死體積以及對(duì)梗死部位具有神經(jīng)保護(hù)作用，而Doeppner T等[14]通過直接對(duì)比MSCs細(xì)胞、MSCs源性外泌體與生理鹽水移植治療缺血性腦卒中大鼠有效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體能增加缺血紋狀體部位神經(jīng)元密度及促進(jìn)缺血后血管生成，其療效持續(xù)時(shí)間與MSCs細(xì)胞移植組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSCs源性外泌體可誘導(dǎo)缺血后的長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體改善腦卒中可能機(jī)制簡(jiǎn)圖注：MSC-EXO：間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體；Immune cell：免疫細(xì)胞；Vascular endothelial cell：血管內(nèi)皮細(xì)胞；Neurons：神經(jīng)元細(xì)胞

MSCs能分泌多種神經(jīng)因子來刺激內(nèi)源性腦修復(fù)過程，主要分泌的神經(jīng)因子包括：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、VEGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,FGF-2)、胰島素生長(zhǎng)因子1(insulin growth factor-1，IGF-1)等[15-16]。由于MSCs外泌體結(jié)構(gòu)的特殊性，可以將MSCs源性外泌體進(jìn)行基因工程修飾，使MSCs源性外泌體中包含特定種類及特定量的細(xì)胞因子或含有特殊小分子或大分子藥物，通過靜脈移植或定向移植入腦受損部位，大大增加其神經(jīng)修護(hù)效果。Xin H等[3,17-18]發(fā)現(xiàn)，通過將MSCs源性外泌體經(jīng)靜脈移植給藥至大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型后，實(shí)驗(yàn)組缺血部位神經(jīng)恢復(fù)加速，并刺激正常組織和缺血組織之間邊界區(qū)的軸突密度增加及血管生成。同組實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)基因工程誘導(dǎo)后過表達(dá)miR-133b的MSCs源性外泌體(MSCs_miR-133b+)移植組增強(qiáng)了卒中大鼠中神經(jīng)功能的恢復(fù)，而基因敲除miR-133b的MSCs源性外泌體(MSCs_miR-133b-)移植組無明顯神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象。同時(shí)，他們?cè)诜聪蝌?yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，MSCs_miR-133b+移植組缺血邊界區(qū)內(nèi)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)(miR_133b的靶標(biāo))的表達(dá)顯著降低，而MSCs_miR-133b-移植組CTGF表達(dá)保持不變。最終得出結(jié)論，MSCs外泌體的miR-133b參與介導(dǎo)缺血性卒中的神經(jīng)功能恢復(fù)。在同研究組的另一項(xiàng)研究中，他們還證明了MSCs衍生的外泌體可以自主遷移至鄰近細(xì)胞。MSCs外泌體包含的miRNA遠(yuǎn)不止一種。隨著研究的深入，越來越多mRNA被發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)功能恢復(fù)相關(guān)，Xin H等[19]最新研究表明，用高表達(dá)miR-17-92 MSCs源性外泌體治療缺血性腦卒中可增加卒中后的神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)，其可能機(jī)制是通過靶向抑制PTEN(經(jīng)驗(yàn)證的miR-17-92簇靶基因)激活PI3K/Akt/mTOR/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。

3.2 MSCs外泌體調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)

當(dāng)血管壁內(nèi)或周圍發(fā)生的異常免疫炎性反應(yīng)可促進(jìn)血栓的形成，最終導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生。且免疫炎性反應(yīng)可以促進(jìn)腦卒中的進(jìn)展，其中多種淋巴細(xì)胞及其衍生的蛋白質(zhì)分子是導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大的重要原因。因此，探索免疫干預(yù)也為治療急性缺血性腦卒中提供可能性。

相對(duì)于MSCs而言，其來源的外泌體分子量小，且其囊泡性質(zhì)使得其移植免疫排斥及其微小。Doeppner TR等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)比假手術(shù)組與MSCs外泌體移植治療MACO大鼠組外周白細(xì)胞亞群及淋巴細(xì)胞亞群總數(shù)，后者外周血中B細(xì)胞，NK細(xì)胞、T細(xì)胞減少及樹突狀細(xì)胞的活化增加，提示MSCs源性外泌體能夠調(diào)節(jié)局灶性缺血對(duì)外周血系統(tǒng)的細(xì)胞組成及其細(xì)胞活化狀態(tài)，并能一定程度逆轉(zhuǎn)腦卒中后誘導(dǎo)的外周免疫抑制。在Chen等[13]的研究中表明，MSCs外泌體能顯著降低梗死部位基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、IL-1β、TNFα、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，RANTES)、NF-κB、CD11和CD68等炎性反應(yīng)因子，提示MSCs源性外泌體抑制了缺血部位的免疫炎性反應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

MSCs移植治療腦卒中的有效性得到許多動(dòng)物研究甚至臨床研究的驗(yàn)證，但MSCs的致瘤性及低存活率在一定程度上限制了MSCs的治療空間。而MSCs分泌的外泌體因其微小的納米尺寸及脂質(zhì)外層結(jié)構(gòu)，可作為天然的生物信息及藥物載體，其獨(dú)特的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)能有效保護(hù)其內(nèi)在生物信息的穩(wěn)定，避免在遷移的過程中被分解，其微小納米尺寸可允許外泌體直接穿過血腦屏障，誘導(dǎo)其在梗死區(qū)發(fā)揮作用，且避免免疫排斥反應(yīng)和微小毛細(xì)血管的阻塞。

現(xiàn)已證明MSCs外泌體所含的多種miRNA參與多種疾病的生理調(diào)節(jié)及損傷組織修復(fù)，其中不僅僅包括缺血性腦卒中，還包括缺血性心肌梗死、肝纖維化、腫瘤等疾病，然而其基本的分子機(jī)制與具體miRNA靶點(diǎn)信息特征并不完全清楚[20]?；贛SCs源性外泌體所含miRNA多樣性，在探索驗(yàn)證與缺血性腦卒中修復(fù)信息相關(guān)miRNA后，可以直接基因誘導(dǎo)編輯MSCs源性外泌體所含生物信息，高表達(dá)某種生物修復(fù)因子或敲除某一基因，靜脈輸注移植或定點(diǎn)移植入梗死區(qū)域，改善缺血性腦卒中癥狀或?qū)⑵渥鳛槿芩ê筝o助治療的一種可能方式。目前對(duì)于MSCs外泌體移植治療缺血性腦卒中仍處于起步階段，其臨床應(yīng)用也許還需很長(zhǎng)時(shí)間的研究，但MSCs源性外泌體在其他學(xué)科基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究中的不斷突破給腦血管病新治療療法奠定了基礎(chǔ)。