鄭忠濤 祝葉 李霞

(?？谑腥嗣襻t(yī)院 1神經(jīng)外科，海南 ?？?570208；2全科醫(yī)學(xué)；3萬(wàn)寧市人民醫(yī)院神經(jīng)外科)

腦膠質(zhì)瘤是老年人群較為常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，也是惡性最高、侵襲性最強(qiáng)的人類(lèi)惡性癌癥之一〔1〕。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療手段包括手術(shù)切除，放射治療和化療〔2〕。然而，所有這些治療策略均已被證明無(wú)法完全抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞，這也是腦膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)率極高的重要原因。我國(guó)研究顯示，腦膠質(zhì)瘤患者的1、2、5年生存率分別為66.0%、45.3%及24.5%，中位生存時(shí)間僅約20個(gè)月〔3〕。目前，化療是腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后采用的最主要的輔助治療方法〔2〕。據(jù)報(bào)道，替莫唑胺是一線化療藥物，對(duì)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有顯著作用〔4〕。雖然替莫唑胺治療已廣泛用于腦膠質(zhì)瘤患者，但由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥性的形成，其治療效率并不是很高〔5〕。然而，固有或獲得性替莫唑胺抗性的機(jī)制尚不清楚。因此，探討替莫唑胺治療耐藥所涉及的分子機(jī)制將有助于提高替莫唑胺化療在腦膠質(zhì)瘤中的療效。微小RNA(miR)是指長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，可通過(guò)靶向靶基因mRNA 3′-非翻譯區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)癌基因和腫瘤抑制基因的表達(dá)〔6〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p在惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制性miR作用〔7〕。然而，關(guān)于miR-145-5p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺化療藥物敏感性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討miR-145-5p對(duì)調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中替莫唑胺化學(xué)敏感性的影響，并探討miR-145-5p及其靶基因的分子機(jī)制，以克服腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療藥物耐藥性問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象納入與標(biāo)本采集 選取2012年2月至2017年2月在?？谑腥嗣襻t(yī)院接受手術(shù)治療的老年腦膠質(zhì)瘤60例，年齡62～76〔平均(67.65±3.76)〕歲，女26例，男34例。腦膠質(zhì)瘤確診依據(jù)病理切片。術(shù)中采集所有患者外周靜脈血5 ml，3 600 r/min離心分離血清。所有患者于術(shù)后口服替莫唑胺膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20040637)，江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，7粒/瓶(50 mg)，75 mg/(m2·d)，4 w為1個(gè)療程，共4個(gè)療程。所有患者門(mén)診隨訪或電話隨訪18個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者復(fù)發(fā)率和生存率。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)，100 U/L青霉素和100 mg/100 L鏈霉素的DMEM改良培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)中，于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。miR-145-5p模擬物，miR-145-5p抑制劑和陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 miR-145-5p對(duì)U87MG細(xì)胞替莫唑胺化療敏感性的檢測(cè) 將U87MG細(xì)胞以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜以形成貼壁附著。次日，用濃度為200 pmol/L的miR-145-5p模擬物和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4 h后，分別加入含有不同濃度替莫唑胺的DMEM，濃度范圍為12.5～800.0 μmol/L，通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞存活率。孵育48 h后，向每個(gè)孔中加入20 μl MTT的完全培養(yǎng)基，孵育4 h后用150 μl二甲基亞砜替換培養(yǎng)基并混合10 min，在492 nm下測(cè)量吸光度，計(jì)算替莫唑胺的半抑制濃度(IC50)值。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 分別使用血清RNA提取試劑盒(武漢生之源生物科技有限公司)與Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取血清和各組細(xì)胞總RNA。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后qRT-PCR檢測(cè)。U6和GAPDH基因分別用作miR-145-5p和RAD18的內(nèi)參。采用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄miR-145-5p。miR-145-5p和U6的逆轉(zhuǎn)錄引物分別是5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTTTCAGTTGATGCATTC-3′和5′-CTCAACTGTGTTGGAGTCGGCAATTCAGTAA-AATATGGAAC-3′。miR-145-5p qRT-PCR的引物序列為：上游5′-CCAGCTGGGCTCACTGAACAATGA-3′和下游5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。U6 qRT-PCR的引物序列為：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。RAD18的引物序列為：上游5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′和下游5′-GGGCAGGCATGTT GACTTCAC-3′，GAPDH的引物序列為：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′和下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。所有引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。每個(gè)樣品檢測(cè)3次，以2-ΔΔCT法來(lái)定量基因表達(dá)水平。

1.5 miR-145-5p靶基因預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 通過(guò)TargetScan在線預(yù)測(cè)RAD18的3′-UTR中miR-145-5p的種子序列，RAD18的野生型全長(zhǎng)3′-UTR片段通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物并用限制酶消化并插入pGLO載體中以產(chǎn)生pGLO-RAD18-wt。從RAD18的3′-UTR突變預(yù)測(cè)的種子序列，使用重疊PCR方法以pGLO-RAD18-mut。以每孔4 000個(gè)U87MG細(xì)胞接種到96孔板中。使用Lipofectamine2000將pGLO-RAD18-wt，pGLO-RAD18-mut和pGLO共轉(zhuǎn)染到具有miR-145-5p模擬物或陰性對(duì)照的細(xì)胞中。使用雙熒光素酶測(cè)定試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。每組重復(fù)測(cè)量3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、miR-145-5p模擬物、替莫唑胺(400 μmol/L)和替莫唑胺(400 μmol/L)+miR-145-5p模擬物孵育48 h后，用Annexin V-APC試劑盒進(jìn)行U87MG細(xì)胞凋亡檢測(cè)，檢測(cè)儀器為美國(guó)伯樂(lè)公司FACS Calibur型流式細(xì)胞儀。應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI染色15 min。以Annexin V-FITC陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組重復(fù)測(cè)量3次。

1.7 Western印跡檢測(cè) 與miR-145-5p模擬物，miR-145-5p抑制劑，陰性對(duì)照，替莫唑胺(400 μmol/L)和替莫唑胺(400 μmol/L)+miR-145-5p模擬物孵育48 h后，在RIPA緩沖液中裂解U87MG細(xì)胞。將等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并與RAD18、Bcl-2、Caspase、GAPDH一抗孵育，再與辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗溫育后，通過(guò)在美國(guó)伯樂(lè)ChemiDoc MP凝膠成像儀上使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)顯現(xiàn)陽(yáng)性條帶。

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)雌性4～6周齡無(wú)胸腺裸鼠(BALB/c，15～20 g)20只，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心〔SCXK (鄂)2016-0016〕，本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)號(hào)：201801006。根據(jù)生物安全及生物倫理指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

將3×106個(gè)U87MG細(xì)胞懸浮于100 μl磷酸鹽緩沖鹽水中并皮下接種到20只裸鼠腹腔中建立腦膠質(zhì)瘤異種移植模型。10 d后當(dāng)腫瘤可見(jiàn)時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分成4組(n=5)，第1組，將陰性對(duì)照(2 nmol)注射到裸鼠腹腔中；第2組，將miR-145-5p(2 nmol)注射到裸鼠腹腔中；第3組，將替莫唑胺(25 mg/kg)注射到裸鼠腹腔中；第4組，將miR-145-5p(2 nmol)和替莫唑胺(25 mg/kg)注射到裸鼠腹腔中。于接種U87MG細(xì)胞后第28天處死裸鼠并切除腫瘤稱重。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism7軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后血清miR-145-5p水平與預(yù)后相關(guān)性 術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-145-5p水平為6.12±1.87(-log)，中位數(shù)為6.01(-log)，依據(jù)miR-145-5p表達(dá)水平的中位數(shù)分為高表達(dá)組(n=30)和低表達(dá)組(n=30)，兩組性別、年齡、吸煙、飲酒史等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。18個(gè)月隨訪后，高表達(dá)組共6例復(fù)發(fā)，2例死亡；低表達(dá)組共14例復(fù)發(fā)，9例死亡。低表達(dá)組復(fù)發(fā)率顯著高于高表達(dá)組(χ2=4.800，P=0.028)；而高表達(dá)組生存時(shí)間顯著高于低表達(dá)組(χ2=5.572，P=0.017，圖1)。

2.2 miR-145-5p表達(dá)與U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性的關(guān)系 用miR-145-5p模擬物和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞后，經(jīng)不同濃度替莫唑胺處理48 h。如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比，隨著替莫唑胺濃度的增加，miR-145-5p模擬物組細(xì)胞活性顯著降低，且miR-145-5p模擬物組可將替莫唑胺的IC50從406 μmol/L降至103 μmol/L。

表1 miR-145-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組間基本資料比較〔n(%),n=30〕

圖1 腦膠質(zhì)瘤術(shù)后血清miR-145-5p水平與患者預(yù)后分析

圖2 miR-145-5p表達(dá)與U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性的關(guān)系

2.3 miR-145-5p靶基因選擇與驗(yàn)證 應(yīng)用TargetScan在線預(yù)測(cè)(圖3)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，pGLO-RAD18-wt組中，miR-145-5p模擬物組的熒光素酶活性(0.89±0.56)顯著高于陰性對(duì)照組(0.27±0.37，P<0.05)；而pGLO-RAD18-mut組中，miR-145-5p模擬物組(0.86±0.47)與陰性對(duì)照組(0.84±0.45)間熒光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示RAD18是miR-145-5p的靶基因。轉(zhuǎn)染48 h后，與陰性對(duì)照組〔13.45±3.54(-log)〕相比，miR-145-5p模擬物組RAD18〔7.04±1.67(-log)〕的mRNA水平明顯降低，miR-145-5p抑制劑組RAD18〔18.98±4.33(-log)〕的mRNA水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 miR-145-5p靶基因的預(yù)測(cè)

2.4 miR-145-5p對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡的影響 與陰性對(duì)照組〔(5.19±0.32)%〕相比，替莫唑胺組〔(19.53±0.90)%〕、miR-145-5p模擬物組〔(17.32±0.77)%〕和替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組〔(36.19±2.06)%〕細(xì)胞凋亡能力均顯著提高(P<0.05)，且替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組細(xì)胞凋亡能力顯著高于替莫唑胺組和miR-145-5p模擬物組(P<0.05)，而替莫唑胺組和miR-145-5p模擬物組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陰性對(duì)照組(RAD18：1.74±0.15，Bcl-2：1.35±0.11，Caspase：1.28±0.11)相比，替莫唑胺組(RAD18：0.83±0.10，Bcl-2：0.79±0.08，Caspase：2.15±0.15)、miR-145-5p模擬物組(RAD18：1.41±0.11，Bcl-2：1.02±0.09，Caspase：1.59±0.13)和替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組(RAD18：0.62±0.07，Bcl-2：0.83±0.08，Caspase：3.97±0.24)的Caspase蛋白顯著增高，RAD18和Bcl-2蛋白顯著降低(P<0.05)；miR-145-5p抑制劑組(RAD18：4.32±0.36，Bcl-2：5.11±0.42，Caspase：0.54±0.06)Caspase蛋白顯著降低，RAD18和Bcl-2蛋白顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

1～5：陰性對(duì)照組、miR-145-5p模擬物組、替莫唑胺組、miR-145-5p抑制劑組、替莫唑胺+miR-145-5p模擬物組圖4 miR-145-5p對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 miR-145-5p對(duì)替莫唑胺在裸鼠體內(nèi)化療敏感性的影響 與陰性對(duì)照組〔(2.45±0.33)g〕相比，單獨(dú)注射替莫唑胺組〔(1.73±0.22)g〕、miR-145-5p組〔(1.91±0.25)g〕及替莫唑胺+miR-145-5p組〔(0.93±0.15)g〕裸鼠的腫瘤質(zhì)量顯著降低，且替莫唑胺+miR-145-5p組的腫瘤質(zhì)量顯著低于替莫唑胺組與miR-145-5p組(P<0.05)。

3 討 論

越來(lái)越多miR與腫瘤相關(guān)的研究表明，miR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性和耐藥性方面發(fā)揮重要作用〔8,9〕。此前報(bào)道指出，miR-145-5p參與乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的發(fā)生并被視為腦膠質(zhì)瘤的腫瘤抑制因子〔7,10〕。最近的證據(jù)表明miR-145-5p可通過(guò)下調(diào)TPT1使泌乳素瘤對(duì)溴隱亭的敏感性增加〔11〕。然而，關(guān)于miR-145-5p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺化療藥物敏感性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果提示，miR-145-5p低表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，且可能與替莫唑胺耐藥相關(guān)。進(jìn)一步分析提示，上調(diào)miR-145-5p可以增加腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化學(xué)敏感性。前期研究證實(shí)，RAD18可通過(guò)下調(diào)p53表達(dá)，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤對(duì)放射治療產(chǎn)生抵抗〔12〕。本研究結(jié)果表明miR-145-5p可作用于RAD18并抑制其表達(dá)。鑒于 RAD18在前期研究中被證實(shí)可使FANCD2和PCNA蛋白的泛素化水平降低，并可抑制細(xì)胞凋亡〔13〕，本研究結(jié)果與前期研究相一致，表明miR-145-5p可通過(guò)抑制RAD18表達(dá)，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Caspase的表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增加膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的敏感性。本研究尚有以下不足之處：①本研究收集的樣本數(shù)量有限，且樣本都來(lái)源于本院，這可能會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生一定偏移，未來(lái)還需更多大樣本多中心的研究對(duì)本次研究的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；②本研究使用U87MG而非腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞，相比之下，原代細(xì)胞最大程度地保留了膠質(zhì)瘤的腫瘤特性，可使結(jié)果的可信度進(jìn)一步提高，因此，未來(lái)可使用腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞對(duì)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。綜上，本研究首次就miR-145-5p調(diào)控替莫唑胺治療腦膠質(zhì)瘤的潛在機(jī)制進(jìn)行探究，并發(fā)現(xiàn)miR-145-5p可通過(guò)靶向抑制RAD18蛋白表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而增加膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的敏感性。這些研究結(jié)果有望為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新思路。