劉 暢， 汪漢成， 謝紅煉， 陳乾麗， 余知和, 孫光軍

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴州 貴陽 550081； 3.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 湖北 荊州 434025； 4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 5.貴州省煙草專賣局， 貴州 貴陽 550003)

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但其病原菌較多，如由煙草白粉病菌(ErysiphecichoracearumDC.)引起的煙草白粉病[1]、由鏈格孢病菌(Alternaraiaalternata)引起的煙草赤星病[2]、由莖點(diǎn)霉病菌(Phomasp.)引起的莖點(diǎn)霉葉斑病[3]、由灰葡萄孢病菌(BotrytiscinereaPer. et Fries)引起的煙草灰霉病[4]、由多主棒孢霉病菌(Corynesporacassiicola)引起的棒孢霉葉斑病[5]、由煙草野火病菌(Pseudomonastabaci)引起的煙草野火病[6]等。在煙草進(jìn)入成熟采烤期后，煙草葉片通常較易感病，且條件適宜時(shí)多種病害?；旌习l(fā)生，未采取藥劑防治的情況下，病害造成的損失可達(dá)50%以上[7]。病害的準(zhǔn)確診斷是病害科學(xué)防治的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的診斷方法通?；诓『Φ奈：ΠY狀。然而，煙草葉片成熟后期，多種病害?；旌习l(fā)生，引起的病癥通常難以辨認(rèn)；且葉片被侵染后，環(huán)境中的腐生菌也易在葉片上定植與危害，進(jìn)而形成復(fù)雜的危害癥狀。此外，局部特殊的氣候環(huán)境也會(huì)引起復(fù)雜的危害癥狀。

近年來，貴州烤煙主產(chǎn)區(qū)銅仁市和黔東南煙區(qū)，煙草赤星病嚴(yán)重發(fā)生，且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在煙草染感赤星病的過程中，有哪些病原菌及腐生病菌會(huì)共同侵染，以及在共同侵染過程中的菌群組成情況鮮有報(bào)道。擴(kuò)增子測(cè)序的分析技術(shù)可以準(zhǔn)確了解環(huán)境樣品的群落結(jié)構(gòu)，已被用于土壤及葉際微生物多樣性的分析[8-10]。然而，將其用于煙草赤星病的葉際微生物多樣性分析還未見報(bào)道。為此，以貴州黔東南感赤星病的煙葉為研究對(duì)象，分析該地區(qū)田間感赤星病煙葉的葉際真菌群落結(jié)構(gòu)，為指導(dǎo)該地區(qū)煙草赤星病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年8月29日，在貴州省黔東南州煙區(qū)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重的煙田進(jìn)行樣品采集。在田間隨機(jī)選取3株嚴(yán)重感赤星病的煙葉，編號(hào)分別為YBBqdL1、YBBqdL2、YBBqdL3，剪刀經(jīng)酒精消毒后剪取發(fā)病葉片，置于無菌取樣袋并分別編號(hào)。將樣品放入低溫保藏箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于―80℃的冰箱保存、備用。

1.2 試劑盒及測(cè)序系統(tǒng)

GeneJET 膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒，均購自Thermo fisher公司。IonS5XL測(cè)序系統(tǒng)由北京諾禾致源科技股份有限公司提供。

1.3 樣品DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

采用CTAB法對(duì)煙葉樣品進(jìn)行DNA提取，具體方法參照李淵等[11]的研究。吸取1000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65℃水浴，期間顛倒混勻數(shù)次使樣品充分裂解。樣品總DNA提取完畢后，濃度和純度使用NanoDrop測(cè)定，純度A260/A280值要求在1.8～2.0。

1.4 ITS文庫構(gòu)建及高通量測(cè)序

以樣品DNA為模板，采用引物ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)樣品的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為30 μL：2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 15 μL，引物(2 μmol/L)3 μL，gDNA(1 ng/μL)2 μL，最后用滅菌的ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至30 μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)其擴(kuò)增質(zhì)量，使用GeneJET膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。將合格的純化樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的IonS5XL進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將IonS5XL下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出fastq文件,即為測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)。根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣本的數(shù)據(jù)，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。質(zhì)控使用Cutadapt軟件(V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)進(jìn)行。使用UCHIME(UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)進(jìn)行嵌合體過濾，得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。使用Uparse(version v7.0.1001)對(duì)所有樣本的Effective Tags以97%的一致性(Identity)進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1),研究各樣本的物種組成，得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再使用Qiime軟件(Version 1.9.1)對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。最后在以上分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類分析等統(tǒng)計(jì)比較分析。以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列測(cè)序深度及數(shù)據(jù)質(zhì)控

稀釋曲線(Rarefaction curve)展示了不同樣品間多樣性的差異。樣本曲線的延伸終點(diǎn)的橫坐標(biāo)位置為該樣本的測(cè)序數(shù)量。從圖1看出，3個(gè)樣品的稀釋曲線在測(cè)序深度為20 000 reads時(shí)趨于平緩，表明測(cè)序已趨于飽和，增加測(cè)序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU，因此，測(cè)序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中所有的物種，測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

感赤星病的3煙株葉部樣品(YBBqdL1、YBBqdL2、YBBqdL3)原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，共得到240 311條高質(zhì)量序列片段，56 761 121個(gè)堿基，單一樣本序列數(shù)在80 054～80 161條，序列平均長(zhǎng)度為236 bp，共檢測(cè)到172個(gè)OTUs。

圖1樣品測(cè)序稀釋曲線(OTU水平shannon指數(shù))

Fig.1 Rarefaction curve for sequencing samples(Shannon index of OTU level)

2.2 OTU聚類

從表1看出，在97%的相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類，3個(gè)不同葉片樣品共鑒定得出真菌5個(gè)門，13個(gè)綱，23個(gè)目，32個(gè)科，37個(gè)屬，28個(gè)種，172個(gè)OTU。

從圖2看出，在OTU水平下，3個(gè)樣本之間真菌種類較為接近，共有的OTU種類遠(yuǎn)高于單個(gè)樣本中獨(dú)有的種類。

2.3 微生物多樣性指數(shù)

從表2看出，YBBqdL1樣本檢測(cè)到的真菌OTU數(shù)量略高于YBBqdL2與YBBqdL3。3個(gè)樣品的覆蓋度指數(shù)均到達(dá)到1，表明測(cè)序結(jié)果合理。豐富度指數(shù)Chao1、Ace均為YBBqdL3樣本真菌群落豐富度高于YBBqdL1與YBBqdL2。多樣性指數(shù)Shannon、Simpson中，YBBqdL1樣本多樣性均高于YBBqdL2與YBBqdL3。譜系多樣性指數(shù)中，YBBqdL3樣本高于YBBqdL1與YBBqdL2。

表1 感赤星病煙株葉片真菌群落不同分類水平總量

圖2赤星病真菌群落Venn圖分析結(jié)果

Fig.2 Venn diagram illustrating with brown spot disease of mycoflora

表2 不同樣本真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

注：Ace和Chao指數(shù)用于表示樣品中細(xì)菌群落豐富度；Shannon和Simpson指數(shù)用于表示樣品中細(xì)菌群落多樣性；Goods coverage指數(shù)用于表示樣品測(cè)序的覆蓋度，指數(shù)值越大，其相應(yīng)的群落豐富度、均勻度和多樣性越高〔Simpson指數(shù)采用Simpson's Index of Diversity(1-D)，其計(jì)算結(jié)果和反映的趨勢(shì)與Shannon指數(shù)同步〕；譜系多樣性指數(shù)反應(yīng)樣品中物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異，指數(shù)值越大說明物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異越大。

2.4 真菌群落組成和結(jié)構(gòu)

從圖3看出，門水平上，YBBqdL1的優(yōu)勢(shì)菌為子囊菌門(Ascomycota 79.46%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota 1.57%)、壺菌門(Chytridiomycota 0.01%)；YBBqdL2的優(yōu)勢(shì)菌為子囊菌門(Ascomycota 86.93%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota 0.20%)、壺菌門(Chytridiomycota 0.01%)；YBBqdL3的優(yōu)勢(shì)菌為子囊菌門(Ascomycota 93.08%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota 0.07%)。屬水平上，YBBqdL1的優(yōu)勢(shì)菌為鏈格孢屬(Alternaria76.04%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma1.88%)、鐮刀霉屬(Fusarium0.43%)、Symmetrospora1.21%)、赤霉菌屬(Gibberella0.29%)、Hannaell0.30%)、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys0.03%)、枝孢霉屬(Cladosporium0.15%)、Stagonosporopsis0.05%)；YBBqdL2的優(yōu)勢(shì)菌為鏈格孢屬(Alternaria85.73%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma0.08%)、鐮刀霉屬(Fusarium0.14%)、Symmetrospora0.13%)、赤霉菌屬(Gibberella0.30%、Hannaell0.01%)、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys0.01%)、枝孢霉屬(Cladosporium0.19%)；YBBqdL3的優(yōu)勢(shì)菌為鏈格孢屬(Alternaria87.23%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma2.34%)、鐮刀霉屬(Fusarium1.81% 、Symmetrospora0.02%)、赤霉菌屬(Gibberella0.40%)、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys0.24%、Plectosphaerella0.20%)、枝孢霉屬(Cladosporium) 0.12% 、Stagonosporopsis0.17%)。

屬水平下的相對(duì)豐度熱圖通過顏色的變化直觀顯示出各樣品豐度前30屬的含量情況(圖4)。使用UPGMA(Unweighted PairGroup Method with Arithmetic mean)算術(shù)平均的非加權(quán)配對(duì)群聚類方法，輸入Bray Curtis距離矩陣，將樣品聚類結(jié)果與 各樣品在門水平上的物種相對(duì)豐度一同展示。通過顏色變化直觀顯示各樣品豐度前10的門的含量情況(圖5)。熱圖左側(cè)的UPGMA聚類樹表明，3個(gè)樣本真群落結(jié)構(gòu)存在差異，因而聚集為兩大類。其中YBBqdL2和YBBqdL3樣品群落結(jié)構(gòu)較相似聚集為一類，YBBqdL1樣品聚為一類，但3個(gè)樣本總體差異不大。

圖3 不同樣品門水平(左)和屬水平(右)的相對(duì)豐度

圖4 屬水平各個(gè)樣品的相對(duì)豐度熱圖

圖5 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹

3 結(jié)論與討論

植物葉片上含有大量提供植物營(yíng)養(yǎng)和抗病相關(guān)的微生物。近年來，葉際微生物逐漸被人們所關(guān)注，并被應(yīng)用于病害防治研究[12-13]。研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草葉際真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，3個(gè)樣品測(cè)序的稀釋曲線在測(cè)序深度為20 000序列數(shù)時(shí)就趨于平緩，而作者測(cè)序深度為30 000序列數(shù)。因此，可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中所有的物種，測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，3個(gè)樣本共得到240 311條高質(zhì)量序列片段，共檢測(cè)到172個(gè)OTUs。研究結(jié)果證實(shí)了高通量測(cè)序技術(shù)在煙草赤星病葉際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性上的可行性。

多年生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和諸多研究均證實(shí)，煙草赤星病為煙草生產(chǎn)中后期的主要病害，煙葉上的病斑以赤星病為主[14]。高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感病煙葉的優(yōu)勢(shì)病原菌為鏈格孢屬，研究結(jié)果與烤煙生產(chǎn)實(shí)際一致。根據(jù)屬水平上的相對(duì)豐度圖還發(fā)現(xiàn),煙草葉際的其他真菌如引起煙草莖點(diǎn)病的莖點(diǎn)霉屬(1.43%)[3]、引起煙草枯萎病的鐮刀霉屬(0.79%)等，這些病原菌是否同樣導(dǎo)致煙草中后期葉部病害以及其與優(yōu)勢(shì)病原菌鏈格孢屬之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。植物病原菌如枝孢霉屬(Cladosporium0.15%)、赤霉菌屬(Gibberella0.29%、Stagonosporopsis)[15]等是否也會(huì)引起煙草葉部病害還需相關(guān)致病力試驗(yàn)驗(yàn)證；植物內(nèi)生真菌粉紅螺旋聚孢霉Clonostachys(0.01%)是多種植物病原真菌重寄生真菌，被認(rèn)為是已發(fā)現(xiàn)的拮抗微生物中最具潛力的植病生防因子之一[16]，其在煙草中后期葉部病害的防控中或具有一定作用。

Ion S5XL高通量測(cè)序技術(shù)已用于煙草赤星病的葉際微生物測(cè)序分析[17]，現(xiàn)階段的結(jié)果有利于了解煙草赤星病的葉際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，為進(jìn)一步研究煙草赤星病的防控奠定了基礎(chǔ)。但測(cè)序樣本數(shù)量有限，且只局限于貴州省黔東南州一個(gè)地區(qū)，今后的研究中有待進(jìn)一步增加樣本數(shù)量，擴(kuò)大采樣范圍，從而使結(jié)果更具普遍性。考慮到煙草赤星病為真菌型病害，對(duì)葉際真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響較大，所以僅分析了真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，并未分析感病煙株葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，相關(guān)研究有待在下一步陸續(xù)開展。