楊二爽，楊文倩，夏云，沈雁

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009)

金納米粒(goldnanoparticles，AuNPs)是一種非常有前景的藥物載體，能夠有效地將藥物輸送到不同的細(xì)胞類型并釋放藥物。金納米粒作為藥物載體具有許多理想的特性［1-3］，例如化學(xué)性質(zhì)惰性、良好的生物相容性。此外，金納米粒具有較大的比表面積，能夠以共價(jià)鍵和物理吸附的方式負(fù)載藥物。研究表明，空腔結(jié)構(gòu)的金屬納米顆粒因?yàn)槠涮厥獾慕Y(jié)構(gòu)而提供了較大的吸收截面，使得光熱轉(zhuǎn)換效率比實(shí)心金屬納米顆粒更高［4］，可以通過局部高溫有效地殺死癌細(xì)胞，在腫瘤治療中很有前景。

藥物與金納米粒相連，一般是經(jīng)過共價(jià)作用或非共價(jià)作用。采用非共價(jià)作用連接藥物-金納米粒的方法雖然簡單快捷，但是在生物體內(nèi)的組織和細(xì)胞微環(huán)境中，結(jié)合在金納米粒表面的藥物分子并不十分穩(wěn)定。而通過共價(jià)作用連接的藥物-金納米粒則提高了藥物分子在體內(nèi)環(huán)境的結(jié)合穩(wěn)定性。金納米粒易被巰基、氨基等基團(tuán)修飾，所以某些分子結(jié)構(gòu)中含有巰基的藥物可以與金納米粒形成Au-S共價(jià)鍵，直接結(jié)合到金納米粒表面，結(jié)構(gòu)中不含巰基的藥物則需要通過一些化學(xué)修飾形成巰基，再結(jié)合到金納米粒表面［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)以抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)為模型藥物，通過化學(xué)修飾制備巰基化阿霉素(DOX-SH)，使之與中空金納米粒(HGNPs)相連，構(gòu)成阿霉素-中空金納米粒復(fù)合載藥體系(HGNPs-DOX)，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并驗(yàn)證其光熱轉(zhuǎn)化能力和細(xì)胞毒性。

1 儀器與材料

1．1 儀器 NewClassic電子天平ML系列(南京科翔儀器設(shè)備有限公司);85-1型磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);BHX型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(南京科爾儀器設(shè)備有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);UPK-I-10T超純水機(jī)(成都超純科技有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);1KD透析袋(南京助研生物科技有限公司);752紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AVANCEAV-500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Agilent1100 LC/DAD/MSD液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司);808 nm耦合激光器(寧波遠(yuǎn)明激光技術(shù)有限公司)。1．2 藥品與試劑 鹽酸阿霉素(含量＞99%，批號：20150801，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司);三乙胺(AR，批號：20140728，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，AR，批號：20160106，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯(AR，批號：181017821K，南京化學(xué)試劑股份有限公司);氯化鈉(AR，批號：1801052，西隴化工股份有限公司);鹽酸羥胺(AR，批號：1706101，上海試四赫維化工有限公司);琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?(SATA，＞94%，批號：160308，阿拉丁);氯金酸(AR，批號：180920，上海科峰實(shí)業(yè)有限公司);二水合檸檬酸三鈉(AR，批號：15011，南京化學(xué)試劑有限公司);硼氫化鈉(AR，批號：151029067F，南京化學(xué)試劑有限公司);氯化鈷(AR，批號：1708092，西隴科學(xué)股份有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，批號：181004，安徽山河藥輔有限公司);噻唑藍(lán)(MTT，批號：170209，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1．3 細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌(A549，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)與方法

2．1 DOX-SH 的合成

2．1．1 DOX-SATA的合成 參考文獻(xiàn)中的制備方法［6］。精密稱取 10．5mgDOX 和 25．2mgSATA 置25mL茄形瓶中，加入3mLDMF使溶解，加入三乙胺6μL，用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)3h(避光)，反應(yīng)后的溶液加入5mL水進(jìn)行稀釋，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，用飽和食鹽水洗滌，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)濃縮，40℃真空干燥。得到DOX-SATA，稱重，除以理論產(chǎn)量，計(jì)算回收率。

2．1．2 DOX-SH 的合成 參考文獻(xiàn)中的制備方法［4］。取純化后的第一步反應(yīng)產(chǎn)物DOX-SATA適量，溶于甲醇中，加入鹽酸經(jīng)胺(DOX-SATA和鹽酸羥胺的摩爾比為1∶100)，加入適量三乙胺調(diào)節(jié)pH為7．4，氮?dú)獗Ｗo(hù)，避光反應(yīng)12h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分有機(jī)溶劑，40℃真空干燥，得到DOX-SH，稱重除以理論產(chǎn)量，計(jì)算回收率。

2．2 DOX-SH 的表征

2．2．1 質(zhì)譜 分別取 DOX、DOX-SATA、DOX-SH 適量，以CD3OD為溶劑，進(jìn)行質(zhì)譜分析，記錄MSESI圖譜。分析DOX、DOX-SATA、DOX-SH的分子量。

2．2．2 氫譜 分別取 DOX、DOX-SATA 適量，以CD3OD為溶劑，頻率500MHz，測試溫度為25℃，進(jìn)行氫譜分析，記錄1H-NMR圖譜。分析DOX、DOXSATA的特征氫化學(xué)位移。

2．3HGNPs-DOX 的制備

2．3．1 HGNPs的制備 在500mL三頸燒瓶中加入300mL 超純水，依次加入 6mL0．05mol·L-1的檸檬酸三鈉溶液、300μL20%PVPK30溶液和300 μL0．4mol·L-1的氯化鈷溶液，抽真空。加入3mL 0．1mol·L-1的硼氫化鈉溶液，變色后攪拌 15min，使過量的硼氫化鈉迅速水解產(chǎn)生氫氣;加入900μL 25mmol·L-1氯金酸溶液，30s后通入空氣攪拌5 min，使剩余的內(nèi)部鈷納米粒核心被氧化，即得HGNPs溶液［7］。

2．3．2 HGNPs-DOX的制備 取一定量 HGNPs溶液置10mL離心管中，向HGNPs溶液中加入適量DOX-SH溶液，在37℃下孵育8h。將孵育結(jié)束后的HGNPs-DOX溶液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，10000rpm離心15min，棄去上清液中未反應(yīng)的DOX-SH，用超純水復(fù)溶［8］。

2．4HGNPs-DOX 的表征

2．4．1 HGNPs-DOX的粒徑分布和Zeta電位 取3 mLHGNPs-DOX溶液，使用激光粒度分析儀測定樣品的粒徑分布和Zeta電位，每個(gè)樣品測定3次。

2．4．2 等離子共振(SPR)吸收峰 取制備好的HGNPs和HGNPs-DOX溶液3mL，以超純水作為空白溶液。采用紫外分光光度計(jì)測定溶液的等離子共振吸收峰和吸收光譜。測量波長范圍為400nm至1000nm。

2．4．3 HGNPs-DOX的形態(tài)表征 利用TEM 觀察HGNPs-DOX的形態(tài)。吸取少量HGNPs、HGNPs-DOX溶液(5mg·mL-1)滴在碳支持膜表面，2～3 min后用濾紙吸去殘留液體，將樣品置于紅外燈下干燥，使用TEM觀察形態(tài)特征。

2．4．4 HGNPs-DOX的體外光熱轉(zhuǎn)化能力 分別配制 0．075、0．15 和 0．30mmol·L-1的 HGNPs 和HGNPs-DOX溶液，各取1mL置石英比色皿中，使用808nm波長激光以1W·cm-2的功率照射10 min，每隔1min使用紅外熱成像儀記錄溫度變化(以pH7．4磷酸鹽緩沖液作為對照)。另取0．30 mmol·L-1的HGNPs-DOX溶液，使用808nm波長激光以1W·cm-2照射2．5min，記錄溫度值，并冷卻至室溫，重復(fù)10次，記錄每次溫度變化。

2．4．5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用 MTT法考察 DOX和HGNPs-DOX的體外細(xì)胞毒性和激光照射后HGNPs-DOX的細(xì)胞毒性。將生長狀態(tài)處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞加入96孔板中，使每孔大約1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，加入含相同DOX濃度的DOX、HGNPs-DOX溶液，每孔加入200μL，另設(shè)置HGNPs-DOX組別，給予1W·cm-2的近紅外光照射5min。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL0．5mg·mL-1的 MTT 溶液。培養(yǎng) 4h 后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，于490nm測定各樣品吸光度(A樣品)。同時(shí)測定調(diào)零孔(A空白)和對照孔(A對照)的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

3 結(jié)果與討論

3．1 DOX-SH 的合成

3．1．1 DOX-SATA的合成 以 DOX和 SATA為原料，在三乙胺的催化下，SATA上琥珀酰亞胺和DOX的伯胺根據(jù)確定的摩爾比反應(yīng)生成DOX-SATA，反應(yīng)式見圖1。產(chǎn)物為紅色粉末狀固體，不溶于水，溶于甲醇等有機(jī)溶劑。產(chǎn)率為90．42%。

圖1 DOX-SATA和DOX-SH的合成

3．1．2 DOX-SH的合成 DOX-SATA的乙?；虼宜狨ピ邴}酸羥胺的作用下脫去乙?；鶊F(tuán)，最終在DOX分子上連接游離的巰基基團(tuán)，反應(yīng)式見圖1。產(chǎn)物為紅色粉末狀固體，不溶于水，溶于甲醇等有機(jī)溶劑。產(chǎn)率為78．53%。

3．2 DOX-SH 的表征

3．2．1 質(zhì)譜 DOX、DOX-SATA和DOX-SH的質(zhì)譜圖見圖2。由DOX和DOX-SATA的質(zhì)譜圖可以看出，DOX的分子離子峰為544．2，DOX-SATA的分子離子峰是659．2，相差一個(gè)硫酯基團(tuán)的分子量，說明硫酯基團(tuán)連接到DOX上，結(jié)果與理論值相符合。而DOX-SH中出現(xiàn)了616．6的分子離子峰，與DOX-SATA的分子離子峰相差43，為脫去的乙?；姆肿恿浚c文獻(xiàn)相符。DOX-SH的質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了大于616的分子離子峰，推測可能是DOX-SH在反應(yīng)過程中，巰基被氧化，形成了二硫鍵，DOX-SH分子之間發(fā)生了交聯(lián)。

圖2 質(zhì)譜圖

3．2．2 氫譜 DOX和DOX-SATA的1H-NMR譜圖見圖3。與DOX的譜圖相比，DOX-SATA的譜圖中在2．5ppm左右出現(xiàn)了兩個(gè)新的質(zhì)子峰，此為硫酯基團(tuán)上的質(zhì)子峰，證明合成的產(chǎn)物中含有硫酯基團(tuán)。結(jié)果與文獻(xiàn)相符。

圖3 1H-NMR譜圖

3．3HGNPs-DOX 的制備

3．3．1 HGNPs的制備 采用鈷模板法制備了 HGNPs，其外觀如圖4(a)所示，所制備的HGNPs呈透明澄清的綠色。外觀均一，無沉淀出現(xiàn)。

圖4 HGNPs和HGNPs-DOX外觀圖

3．3．2 HGNPs-DOX的制備 采用鈷模板法制備了中空金納米粒，其外觀如圖4(b)所示，所制備的HGNPs-DOX呈透明澄清的灰色，無聚集顆?；蛘叱恋沓霈F(xiàn)，外觀均一，與HGNPs相比，顏色偏灰。

3．3．3 HGNPs-DOX 的粒徑分布和 Zeta 電位

HGNPs和HGNPs-DOX的粒徑分布見圖5。HGNPs的粒徑為(53．00±0．196)nm，Zeta 電位為(-55．44±3．88)mV;與 HGNPs相比，HGNPs-DOX 的粒徑稍有增加為(72．00±0．131)nm，Zeta 電位為(-39．51±3．62)mV。HGNPs和HGNOPs-DOX的粒徑逐漸增大。

3．3．4 等離子共振(SPR)吸收峰 如圖6所示，所制備的HGNPs等離子共振吸收(SPR)吸收峰最大吸收波長為780nm左右;HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長為800nm。金納米粒可以吸收近紅外光，這使其可以將光能轉(zhuǎn)化為熱能。而SPR最大吸收波長在808nm附近的HGNPs，光熱轉(zhuǎn)化的效率更高。以上結(jié)果表明，HGNPs和HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長為800nm左右。HGNPs、HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長依次出現(xiàn)紅移。

圖5 粒徑分布

圖6 吸收光譜圖

3．3．5 HGNPs-DOX 的形態(tài)表征 HGNPs 和HGNPs-DOX在透射電鏡下的形態(tài)圖見圖7?？梢钥闯鲋苽浜玫腍GNPs外形呈圓球形，內(nèi)部具有空腔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為50nm左右，殼厚為4～6nm，這與實(shí)際測得的粒徑也相符合。HGNPs-DOX仍然呈現(xiàn)出空腔結(jié)構(gòu)的圓球形，但在其外表有一層透明的膜狀物，其厚度大約為5nm左右。HGNPs-DOX的粒徑大于HGNPs，一方面是因?yàn)榘⒚顾刎?fù)載到其表面，另一方面可能是由于阿霉素的負(fù)載，使得HGNPs表面水化層的存在。

圖7 透射電鏡下的形態(tài)圖

圖8 HGNPs(a)和HGNPs-DOX(b)的溫度變化與重復(fù)10次照射后HGNPs和HGNPs-DOX(c)的溫度變化

3．3．6 HGNPs-DOX的體外光熱轉(zhuǎn)化能力 由圖8可以看出，HGNPs和HGNPs-DOX的體外光熱轉(zhuǎn)化能力呈時(shí)間依賴和劑量依賴性。在較低濃度時(shí)，與PBS相比，HGNPs和HGNPs-DOX在808nm波長激光照射下，其溫度隨時(shí)間的延長而顯著增加。且溫度變化隨濃度的增加而增加。而HGNPs和HGNPs-DOX相比，兩者在不同濃度下的溫度增加無明顯差異。采用808nm波長激光照射2．5min，并重復(fù)10次，可以看出HGNPs和HGNPs-DOX在每次照射以后達(dá)到的最高溫度都在60℃左右，且HGNPs和HGNPs-DOX的溫度變化無顯著性差異。這提示在多次照射以后，金納米粒的光熱轉(zhuǎn)化能力并不會降低。以上結(jié)果表明，制備得到的HGNPs-DOX可以將光能轉(zhuǎn)化為熱能，具有良好的體外光熱性能，這為其后期的熱療研究提供了可能。

3．3．7 細(xì)胞毒性 加入DOX、HGNPs-DOX的細(xì)胞存活率見圖9所示?？梢钥闯?，DOX對A549細(xì)胞具有較大的毒性，其 IC50為 11．24μg·mL-1。在較高濃度下，中空金納米粒能有效地降低阿霉素對細(xì)胞的毒性。采用1W·cm-2的近紅外光照射5min以后，在高濃度下，其細(xì)胞毒性增加，可能是由于在近紅外光的照射下，阿霉素從載體中釋放出來。而較低濃度時(shí)細(xì)胞毒性無明顯變化，可能是由于在濃度較低時(shí)，阿霉素的細(xì)胞毒性較小。以上結(jié)果表明，將阿霉素負(fù)載到HGNPs上，能顯著降低阿霉素的毒性，且在近紅外光的照射下能夠促進(jìn)阿霉素的釋放，使得細(xì)胞存活率降低。

圖9 DOX、HGNPs-DOX的細(xì)胞存活率(n=6，*P＜0．05，＊＊P＜0．01)

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用SATA試劑制備了DOX-SH，該方法操作簡單，合成過程副反應(yīng)較少，產(chǎn)率較高，方法較為可行。制備了HGNPs-DOX，其粒徑70nm左右，粒徑均一，分散性能良好，最大吸收波長為800 nm左右，光熱轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明該材料具有很好的光熱性能，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明該材料具有較小的毒性，且近紅外光的照射能夠促進(jìn)DOX的釋放。本研究為金納米粒載藥系統(tǒng)研究用模型藥物的巰基化，提供了一種較為可行的合成方法。其次，HGNPs-DOX載藥體系可以用于化療聯(lián)合熱療研究，具有極大的研究價(jià)值。