劉麗亞，薛云，戴曉莉

(1．南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518110;2．山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250100)

丹紅注射液是由丹參和紅花提取分離的復(fù)方中藥制劑。丹紅注射液的主要功效為活血化瘀和通脈舒絡(luò)，臨床上用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦血栓等［1-4］。盡管中藥注射液在國(guó)內(nèi)臨床上應(yīng)用廣泛，但其療效不確切，安全事故頻發(fā)，故國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥注射液爭(zhēng)議較大。2017年深化藥品器械醫(yī)療審評(píng)審批制度改革的重點(diǎn)工作之一就是中藥注射液的有效性和安全性再評(píng)價(jià)工作。本實(shí)驗(yàn)室按照中藥注射劑再評(píng)價(jià)要求，采用下腔靜脈阻斷法制備大鼠靜脈血栓模型，通過檢測(cè)出血時(shí)間、血漿纖維蛋白原含量、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和血栓重量等指標(biāo)，全面考察丹紅注射液對(duì)大鼠下腔靜脈阻斷血栓模型的改善作用，以期為丹紅注射液的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1．1 動(dòng)物 SD大鼠200～220g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。SPF級(jí)動(dòng)物房［SYXK(魯)2014-0008］飼養(yǎng)。溫度20～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)8～10次/h，動(dòng)物自由飲食飲水。

1．2 藥品與試劑 丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供，批號(hào)：150832);阿加曲班注射液(天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20150634);纖維蛋白原、凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間試劑盒均由上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司提供。

1．3 儀器 AY220型電子分析天平(島津有限公司);C2000型血凝儀(北京東方普利生科貿(mào)有限公司);TDL-5臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

2 方法

2．1 劑量設(shè)計(jì) 丹紅注射液臨床用法為成人每天8 mL。按成人70kg和200g大鼠等效劑量折算系數(shù)法可得大鼠用藥劑量為 8mL×0．018×5=0．72 mL·kg-1，故本試驗(yàn)可設(shè)丹紅注射液低、中、高劑量分別為 0．5、1、2mL·kg-1。

2．2 大鼠深靜脈血栓形成模型的建立［4-5］取健康雄性大鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，分偽手術(shù)組、模型組、丹紅注射液 2、1、0．5mL·kg-13 個(gè)劑量組和阿加曲班注射液1．8mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組。手術(shù)前所有動(dòng)物禁食12h，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，仰臥固定，備皮消毒，于下腹部正中縱行3～4cm切口打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，將4號(hào)絲線與下腔靜脈并行，用Prolene線將腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈與絲線一起結(jié)扎，并在結(jié)扎線下方用血管阻斷夾夾住血管，然后將絲線抽出后取下血管阻斷夾。手術(shù)完成后關(guān)閉腹腔，術(shù)后仔細(xì)護(hù)理至大鼠清醒。偽手術(shù)組所有操作同模型組，但不結(jié)扎和夾閉血管。造模后各給藥組尾靜脈給予相應(yīng)劑量的藥物溶液，10mL·kg-1，每天給藥1次，連續(xù)給藥3d，模型組和偽手術(shù)組給予等容積的生理鹽水。

2．3 指標(biāo)檢測(cè)［4-5］給藥前和末次給藥后5h，用鋒利的刀片橫切大鼠尾部5mm，每30s用濾紙吸去，直至出血停止，記錄出血時(shí)間。藥后6h，重新打開腹腔，從后腔靜脈上段取血，測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)及凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原含量(FIB)。取血同時(shí)，在結(jié)扎下方2cm處夾閉管腔，取出瘀血段血管，剖開管腔，取出血栓，放在濾紙上，吸干血液，稱取血栓濕重(mg)，然后將血栓置培養(yǎng)皿中在室溫下放置24h，稱取血栓干重(mg)。

2．4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用DAS2．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，組間指標(biāo)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。采用P＜0．05或0．01表示統(tǒng)計(jì)差異性。

3 結(jié)果

3．1 對(duì)模型大鼠出血時(shí)間的影響 偽手術(shù)組大鼠給藥前后出血時(shí)間未見明顯變化，模型組大鼠造模后出血時(shí)間一定程度降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。丹紅注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后出血時(shí)間與給藥前比較均顯著延長(zhǎng)(P＜0．05或 P＜0．01)。丹紅注射液 2 mL·kg-1與阿加曲班注射液1．8mg·kg-1劑量組大鼠的出血時(shí)間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，而丹紅注射液1、0．5mL·kg-1劑量組大鼠出血時(shí)間明顯短于阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1劑量(P＜0．05 或 P＜0．01)，結(jié)果見表 1。

表1 丹紅注射液對(duì)模型大鼠出血時(shí)間的影響(，n=10)

表1 丹紅注射液對(duì)模型大鼠出血時(shí)間的影響(，n=10)

注：與給藥前比較，*P＜0．05，＊＊ P＜0．01;與給藥前比較，#P＜0．05，##P＜0．01

組別 劑量 給藥前出血時(shí)間/s給藥后出血時(shí)間/s偽手術(shù) - 477±226 495±211模型 - 462±129 376±151阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 488±135 962±167＊＊2mL·kg-1 447±147 853±137＊＊丹紅注射液 1mL·kg-1 480±138 722±120*#0．5mL·kg-1 459±148 583±139##

3．2 對(duì)模型大鼠凝血時(shí)間和血漿纖維蛋白原含量的影響 與偽手術(shù)組比較，模型大鼠血漿纖維蛋白原含量升高，凝血時(shí)間延長(zhǎng)。與模型組比較，丹紅注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1劑量組大鼠給藥后TT、APTT和PT顯著延長(zhǎng)，血漿纖維蛋白原含量明顯降低(P＜0．05或 P＜0．01)，結(jié)果見表2。

表2 丹紅注射液對(duì)模型大鼠凝血時(shí)間和纖維蛋白原含量的影響(，n=10)

表2 丹紅注射液對(duì)模型大鼠凝血時(shí)間和纖維蛋白原含量的影響(，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與偽手術(shù)組比較，##P＜0．01

組別 劑量 APTT/s PT/s TT/s FIB/g·L-1偽手術(shù) - 21．3±1．1 12．3±1．3 30．7±1．2 1．84±0．45模型 - 19．6±1．8# 11．0±0．8# 29．2±1．0# 2．68±0．36##阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 24．5±0．9＊＊ 16．8±1．4＊＊ 35．9±1．2＊＊ 1．78±0．24＊＊2mL·kg-1 22．9±1．9＊＊ 15．8±1．2＊＊ 33．8±1．5＊＊ 1．91±0．32*丹紅注射液 1mL·kg-1 21．5±1．4* 13．2±1．7* 31．9±1．6* 2．03±0．27*0．5mL·kg-1 20．4±1．3 11．9±1．2 29．8±1．5 2．22±0．46

3．3 對(duì)模型大鼠血栓重量的影響 偽手術(shù)組未見血栓形成，模型大鼠出現(xiàn)明顯血栓。與模型組比較，丹紅注射液2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液1．8 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后血栓濕重和干重均明顯降低(P＜0．05 或 P＜0．01);而丹紅注射液 0．5 mL·kg-1劑量組大鼠血栓重量亦有所降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表3。

表3 丹紅注射液對(duì)模型大鼠血栓重量的影響，n=10)

表3 丹紅注射液對(duì)模型大鼠血栓重量的影響，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01

組別 劑量 血栓濕重/g 血栓干重/g偽手術(shù) - - -模型 - 20．9±3．8 5．4±1．3阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 14．2±2．9＊＊ 3．4±1．1＊＊2mL·kg-1 16．5±3．2* 3．6±0．9＊＊丹紅注射液 1mL·kg-1 18．1±1．8* 4．0±0．8*0．5mL·kg-1 19．1±2．8 4．5±0．6

4 討論

利用大鼠制備深靜脈血栓形成(DVT)動(dòng)物模型已有60多年的歷史，共有18種動(dòng)物可用于DVT的模型制備。大鼠與犬、豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比復(fù)制DVT模型具有重復(fù)性好、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，故采用較多。腎靜脈血栓形成最重要的3個(gè)因素為血流淤積、靜脈內(nèi)皮損傷及血液高凝集。因此要圍繞這3種因素，選擇合適的處理方式進(jìn)行DVT模型制備。通過接扎靜脈模擬血流淤積是最簡(jiǎn)便、應(yīng)用最多模型制備方式。本文通過縮窄下腔靜脈，同時(shí)血管阻斷夾阻斷并結(jié)扎腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈各屬支的方法，建立了大鼠DVT疾病模型［6］。結(jié)果顯示，模型組大鼠凝血時(shí)間縮短，纖維蛋白原含量升高，出現(xiàn)明顯的血栓，證明模型制備成功。

預(yù)測(cè)血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一就是纖維蛋白原，纖維蛋白原水平升高后心血管事件的發(fā)生率亦明顯升高。纖維蛋白原為血液中含量最高的凝血因子，其含量升高可明顯促進(jìn)血液凝固和血小板聚集。纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白和不溶性降解產(chǎn)物后啟動(dòng)血栓形成的過程;纖維蛋白原和紅細(xì)胞均為決定血液黏度的最重要因素，其水平升高可增加血漿黏度和改變血流變指標(biāo)，進(jìn)而促進(jìn)血栓形成［7］。本試驗(yàn)結(jié)果證明，模型組纖維蛋白原含量明顯升高，丹紅注射液1mL·kg-1劑量以上可顯著降低纖維蛋白原含量，延長(zhǎng)出血和凝血時(shí)間，明顯降低模型大鼠腎靜脈血栓干重和濕重，對(duì)腎靜脈血栓形成有明顯的抑制作用。其作用機(jī)制可能為通過其有效成分迷迭香酸、丹參酚酸和對(duì)香豆酸來抑制多個(gè)誘導(dǎo)血小板黏附、聚集及其下游鈣離子和cAMP信號(hào)通路的G蛋白耦聯(lián)受體激動(dòng)劑而發(fā)揮作用［8-9］。