茹鑫

（上海康識食品科技有限公司，上海 201103）

茶葉作為中華民族的傳統(tǒng)飲品已有上千年的歷史，并且被廣泛認為是一種具有保健功效的重要飲品[1-2]。長期以來，人們對茶葉的利用方式主要以泡制飲用為主。近年來，隨著食品加工技術的發(fā)展，茶葉的利用方式呈現多元化發(fā)展，從單一的飲用逐漸發(fā)展到飲用、食用、日用，有大量關于茶葉中功能成分在醫(yī)藥、日化、輕化、食品、油脂、保健等諸多方面的研究[3-9]。茶葉中含有較多的可利用成分，但是茶飲料、速溶茶等深加工所提取的成分只占茶葉的一部分，而茶渣中仍然含有膳食纖維、蛋白質、茶多糖、茶黃素等各種營養(yǎng)成分，具有很高的利用價值[10-13]。隨著人們健康觀念的不斷提升，逐漸認識到膳食纖維具有獨特的生理作用，在保持消化系統(tǒng)健康方面有著突出效果，在預防慢性疾病方面越來越受到研究的重視，并已發(fā)展成為一種極為重要的功能性食品原料[14-15]。茶渣中含有大量的膳食纖維，制成茶葉膳食纖維產品的消化特性及其保健功效將直接影響其在食品中的應用。因此，文章選用經過浸提后的綠茶作為原料，將其粉碎成膳食纖維粉，并對其組成成分進行分析。然后采用胃蛋白酶-胰酶兩步測試法建立體外消化模型以模擬體內消化環(huán)境，從而對茶葉膳食纖維粉在人體內的消化特性進行初步探討，最后通過測試排便和腸道運動情況的動物實驗來評價其通便功能，期望能夠通過這些研究幫助茶葉膳食纖維粉應用于具有通便和減肥功能的食品設計中，實現茶葉資源更進一步地利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉：市售綠茶（武陽早，浙江）；活性炭粉：國藥集團化學試劑有限公司 （F20110506）；全麥粉（市售，山東濰坊全麥粉）；胃蛋白酶：美國Sigma公司，酶活≥250 units/mg；胰蛋白酶，美國Amresco公司；阿拉伯樹膠粉：國藥集團化學試劑有限公司（F20101026）；復方地芬諾酯片：山東仁和堂藥業(yè)有限公司，國藥準字（H37021525，批號1506）；手術剪、眼科鑷、直尺、注射器、電子天平；雄性SPF級昆明鼠：上海市斯萊克實驗動物有限責任公司動物，動物合格證號：（SCXK（滬）2013-0016）。

墨汁的配制：準確稱取阿拉伯樹膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭5 g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液涼后加水定容到100 mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

復方地芬諾酯混懸液的配制 （濃度為0.5 mg/mL）：取復方地芬諾酯片10 mg，用研缽研碎呈粉末后加水至20 mL臨用前配制。

1.2 方法

1.2.1 茶葉膳食纖維粉的制備[16]

取一定量優(yōu)質綠茶，加入10倍水量，升溫至80℃水提1次，提取時間為40 min；經過螺桿擠壓機（壓力0.5 MPa，時間15 s）后，再經過干燥機（溫度120℃，干燥時間4 h）將茶葉的水分干燥到10%后，經球磨機將茶葉粉碎后過篩得到茶葉膳食纖維粉。

1.2.2 茶葉膳食纖維粉的基本成分檢測

水分參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》方法測定；粗多糖參照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚—硫酸法》測定；蛋白質參照GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》方法測定；茶多酚參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定；總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維參照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》方法測定。

1.2.3 茶葉膳食纖維粉的消化特性研究

針對茶葉膳食纖維粉中的主要成分蛋白質和膳食纖維，按照人體的基本消化流程，先胃蛋白酶作用后胰蛋白酶作用的順序，優(yōu)化蛋白酶的適宜量，經類似腸胃蠕動的慢搖動方式進行體內消化環(huán)境模擬。茶葉膳食纖維粉在胃、腸模擬體系消化之后，沉淀物經65℃恒重干燥后研磨、取樣，以全麥蛋白為標準對比茶葉膳食纖維粉中蛋白質的消化情況。

1.2.3.1 胃腸消化模擬實驗[17]

胃部消化模擬：取pH=2的磷酸緩沖溶液20 mL于250 mL錐形瓶，準確加入茶葉膳食纖維粉樣品（或全麥粉對比樣品）2 g，加入適宜量胃蛋白酶；用1 mol/L的HCL或1 mol/L的NaOH調pH至2；再加入0.5 mL氯霉素（0.5 mg/mL乙醇），抑制細菌生長；加鋁箔后置于全溫搖瓶柜中37℃，120 r/min消化 4 h。

小腸消化模擬：胃部模擬消化后樣品用2 mL NaOH（0.6 mol/mL）中和；加入 10 mL pH=6.8 的磷酸緩沖溶液；再用1 mol/L的HCL或1 mol/L的NaOH調pH至6.8；加入適宜量胰蛋白酶后，置于全溫搖瓶柜中37℃，120 r/min消化6 h。

1.2.3.2 蛋白消化率的測定

消化后的樣品經8000 rpm離心，除去上清液，沉淀物經65℃，24 h干燥恒重。干燥樣品研磨后，稱重。樣品消化前和消化后的殘渣中的蛋白質含量采用凱氏定氮法測定。

蛋白質消化率=（消化前樣品蛋白質含量－消化后沉淀物蛋白質含量）/消化前樣品蛋白質含量

1.2.4 茶葉膳食纖維粉的通便功能研究

采用 《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范實施手冊》（2003年出版）“通便功能檢驗方法”。受試物茶葉膳食纖維粉人體擬服用劑量為4 g/d（折合不溶性膳食纖維約為2 g/d），以此折算小鼠劑量，實驗設置劑量序列為人體劑量的5倍、10倍、30倍3個劑量處理組，目的是觀察人體等量劑量同時，了解對于小鼠各個劑量是否有相似的功能作用。

1.2.4.1小腸推進實驗

經口灌胃給予造模藥物復方地芬諾酯，建立小鼠小腸蠕動抑制模型，計算一定時間內小腸的墨汁推進率，來判斷模型小鼠胃腸蠕動功能。小白鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，受試品低、中、高三組劑量組，每組10只。茶葉膳食纖維粉雙蒸水配制后灌胃給予，給藥體積為20 mL/kg，空白對照組和模型對照組同樣途徑同樣體積給雙蒸水。

（1）小鼠體重和每日進食量測定

每天于第一次灌胃前稱量小鼠體重 （精確到0.1 g），據此計算每日灌胃量。每天固定給每籠小鼠一定量的鼠糧（50.0 g），于次日同一時間稱量剩余鼠糧重量（精確到0.1 g），即可算出小鼠每日進食量。

（2）小鼠便秘模型建立

給茶葉膳食纖維粉7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組和三個劑量組灌胃給予復方地芬諾酯（5 mg/kg·BW），給藥體積為 10 mL/kg，空白對照組給同體積雙蒸水。

（3）指標測定的方法

給復方地芬諾酯后0.5 h，劑量組分別給予含相應受試樣品的墨汁 （含5%的活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白和模型對照組給墨汁灌胃。25 min后立即脫頸椎處死動物，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，自幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按下式計算墨汁推進率：

墨汁推進率按下式進行數據轉換獲得X，式中：P為墨汁推進率，用小數表示。

1.2.4.2 排便時間、糞便粒數和糞便重量的測定

經口灌胃給予造模藥物復方地芬諾酯，建立小鼠便秘模型，測定小鼠的首粒排黑便時間、6 h內排便粒數和排便重量，來反應模型小鼠的排便情況。小白鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，受試品低、中、高三組劑量組，每組10只。茶葉膳食纖維粉經雙蒸水配制后灌胃給予，給藥體積為20 mL/kg，空白對照組和模型對照組同樣途徑同樣體積給雙蒸水。

（1）小鼠體重和每日進食量測定

每天于第一次灌胃前稱量小鼠體重 （精確到0.1 g），據此計算每日灌胃量。每天固定給每籠小鼠一定量的鼠糧（50.0 g），于次日同一時間稱量剩余鼠糧重量（精確到0.1 g），即可算出小鼠每日進食量。

（2）小鼠便秘模型建立

給茶葉膳食纖維粉7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組和三個劑量組灌胃給予復方地芬諾酯（10 mg/kg·BW），給藥體積為 10 mL/kg，空白對照組給同體積雙蒸水。

（3）指標測定的方法

給予復方地芬諾酯0.5 h后，劑量組分別給予含相應受試樣品的墨汁 （含5%的活性碳粉、10%阿拉伯樹膠），空白和模型對照給予墨汁灌胃，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌胃墨汁開始，記錄每只小鼠首粒排黑便時間，6 h內的排便總粒數及重量，觀察記錄糞便性狀 （大小、軟硬程度等）。

1.3 數據處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件用進行實驗數據處理，計量資料用均數±標準差（X±s）表示，以 p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

在小腸便秘模型成立的前提下，受試樣品組小鼠墨汁推進率顯著高于模型對照組的墨汁推進率時，可判定該項實驗結果陽性。受試樣品組小鼠首粒黑便時間明顯短于模型對照組，即可判定該項指標結果陽性。6 h內排黑便粒數明顯高于模型對照組，可判定該項指標結果陽性。6 h內排黑便重量明顯高于模型對照組，可判定該項指標結果陽性。

2 結果與分析

2.1 茶葉膳食纖維粉的基本成分分析

表1顯示了茶葉膳食纖維粉的基本成分含量，其主要組成成分為蛋白質（22.28%）和膳食纖維（58.40%），所以實驗以蛋白質消化率作為指標來考察茶葉膳食纖維粉的消化特性。

表1 茶葉膳食纖維粉的基本成分分析Table 1 Component analysis of tea dietary fiber powder

2.2 茶葉膳食纖維粉的消化特性研究

2.2.1 胃蛋白酶最適量的優(yōu)化

由圖1可以看出，茶葉膳食纖維粉中蛋白質隨著胃蛋白酶的添加消化率逐漸增加，當達到5 mg/g濃度時，相同消化條件下，消化率的增長開始趨緩。根據植物蛋白的水溶性差異，可推測：酶添加量小于5 mg/g茶粉時，消化的主要為游離水溶性蛋白，蛋白質消化率的增加與酶的添加量呈線性正相關；酶添加量大于5 mg/g濃度時，胃蛋白酶開始水解部分纖維間蛋白，蛋白質消化率的增加隨酶的添加量線性關系不明顯。

圖1蛋白質消化率隨胃蛋白酶添加量變化趨勢Fig.1 Protein digestibility varied with the amount of pepsin

由圖2可以看出，當胃蛋白酶添加量由15 mg/g增加到20 mg/g時，蛋白質消化率的增量比胃蛋白酶添加量由10 mg/g增加到15 mg/g時下降了2.2%。當胃蛋白酶增加到15 mg/g濃度以后，蛋白質消化率增量已經下降明顯，所以選擇15 mg/g濃度作為胃蛋白酶體外模擬消化最適添加量的條件。

圖2 蛋白質消化率增量隨胃蛋白酶添加量增量變化趨勢Fig.2 The increment of protein digestibility varied with the increment of pepsin

2.2.2 胰蛋白酶最適量的優(yōu)化

由圖3和圖4可以看出，隨著胰蛋白酶的添加，茶葉膳食纖維粉中的游離蛋白以及纖維間蛋白消化率逐漸增加。當胰蛋白酶在茶葉膳食纖維粉胃蛋白酶消化液中的添加量由15 mg/g增加到20 mg/g時，蛋白的消化率增量趨零 （增量為0.09%）。

所以，最終確定體外消化模擬實驗條件為：胃蛋白酶的最優(yōu)活性條件為pH=2，添加量15 mg/g，消化4 h；在15mg/g蛋白酶添加量的消化條件下，胰蛋白酶的最優(yōu)pH=6.8，添加量為15 mg/g，消化時間6 h，以此分別模擬在胃環(huán)境消化4 h和小腸環(huán)境消化6 h。

2.2.3 茶葉膳食纖維粉體的外消化對比

由表2可以看出，在上述最優(yōu)消化條件下，測得茶葉膳食纖維粉的蛋白消化率為39.03%，全麥粉同等條件下消化率可以達到90.49%，相比之下兩者在蛋白消化率上有非常明顯的差異。經查閱資料，分析其原因：茶葉膳食纖維粉中大部分蛋白為谷蛋白等非水溶性蛋白，難以被胃蛋白酶消化[11]；兩者的不可溶膳食纖維含量差異明顯，不可溶膳食纖維也會對蛋白質在胰蛋白酶消化過程產生不利影響[18-20]。

圖3 蛋白質消化率隨胰蛋白酶添加量變化趨勢Fig.3 Protein digestibility varied with the amount of trypsin

圖4 蛋白質消化率增量隨胰蛋白酶添加量增量變化趨勢Fig.4 The increment of protein digestibility varied with the increment of trypsin

表2 茶葉膳食纖維粉和全麥粉的數據對比Table 2 The data comparison between tea dietary fiber powder and whole wheat flour

2.3 茶葉膳食纖維粉的通便功能研究

2.3.1 小鼠小腸推進率的影響

經口給予各組小鼠受試品7 d，各組動物體重無顯著性差異。各組實驗結果見表3。

表3 茶葉膳食纖維粉對小鼠小腸推進率的影響（n=10，X±s）Table 3 Effect of tea dietary fiber powder on the small intestine advance rate of mouse （n=10，X±s）

模型對照組與空白對照組對比，小腸推進率和X值都有顯著性降低（p＜0.01），說明造模成功。與模型對照組相比，受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠的小腸推進率 （與模型對照組比較p＜0.01）和X值都有顯著性升高（與模型對照組比較p＜0.05）；受試物茶葉膳食纖維粉低、高劑量組小鼠小腸推進率和X值均有升高的趨勢，但沒有出現顯著性差異（與模型對照組比較p＞0.05）。故可判定中劑量組茶葉膳食纖維粉對小鼠小腸推進結果陽性。

2.3.2 排便情況實驗

經口給予各組小鼠不同劑量的受試品7 d，各組動物體重無顯著性差異。模型對照組與空白對照組相比，小鼠首粒排黑便時間明顯延長（與模型對照組比較p＜0.01），6 h內排黑便粒數及重量都有顯著性降低（與模型對照組比較p＜0.05），說明造模成功。各組實驗結果見表4。

表4 茶葉膳食纖維粉對小鼠排便情況的影響（n=10，X±s）Table 4 Effect of tea dietary fiber powder on defecation situation （n=10，X±s）

與模型對照組相比，受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠的首粒排黑時間顯著性縮短 （與模型對照組比較p＜0.05），受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠6 h內排黑便粒數及重量有升高的趨勢，但沒有出現顯著性差異 （與模型對照組比較p＞0.05）。受試物茶葉膳食纖維粉高劑量組小鼠首粒排黑便時間顯著性縮短（與模型對照組比較p＜0.01）。6 h內排黑便粒數及重量均有顯著性升高（與模型對照組比較p＜0.01）。受試物茶葉膳食纖維粉低劑量組小鼠首粒排黑便時間有縮短的趨勢，6 h內排黑便粒數及重量有升高的趨勢，但沒有出現顯著性差異 （與模型對照組比較p＞0.05）。判定高劑量組茶葉膳食纖維粉對小鼠首粒排黑便時間、6 h內排黑便粒數及重量結果為陽性。

3 討論

（1）茶葉膳食纖維粉的主要組成成分為蛋白質和膳食纖維，經過和全麥粉相同消化條件下的對比實驗發(fā)現，在體外胃腸消化模擬實驗中茶葉膳食纖維粉中蛋白質消化率較低，因為茶葉膳食纖維粉中不可溶膳食纖維含量過高導致難以消化，所以目前在茶制品生產中不能大量使用。

（2）下一步可以考慮采用膨化技術破壞膳食纖維晶格結構，達到暴露蛋白質的目的，以期可以提高茶葉膳食纖維粉中蛋白的消化率，使其可以經人體充分消化、吸收和利用，減少食用后的不適感。

（3）經動物實驗結果表明，小腸運動實驗為陽性，且首粒排黑便時間結果和6 h內排便重量和糞便粒數結果為陽性，所以可以判定茶葉膳食纖維粉具有良好的通便功能，在后續(xù)的產品開發(fā)中，可以將茶葉膳食纖維粉應用于具有通便和減肥功能的食品設計。