李濤,李和繁,徐偉江

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，教育部生物質(zhì)能可持續(xù)發(fā)展與利用工程研究中心,云南 昆明 650500)

中華山蓼(Oxyriasinensis)是蓼科(Polygonaceae)山蓼屬(Oxyria)植物[1]，該植物具有雌雄異株的特點(diǎn)，主要分布在云南、四川以及西藏地區(qū)海拔1 600-3 800 m的山坡和山谷等環(huán)境資源較為匱乏的地方，且常見于銅鋅礦區(qū)，被認(rèn)為是銅礦的指示植物，因此中華山蓼又被稱為銅礦草[2].中華山蓼可以克隆生長[3]，同時具有較強(qiáng)的抗旱能力[4]，因此中華山蓼能在惡劣的環(huán)境中通過根的克隆生長迅速占領(lǐng)生境，是一種較好的先鋒植物.由于中華山蓼具有在礦區(qū)生長和克隆繁殖的特性，故可以作為礦區(qū)植被恢復(fù)的重要植物.然而，目前對中華山蓼在重金屬脅迫下的相關(guān)研究還非常少，限制了對這一物種的合理利用.

當(dāng)植物受到重金屬銅脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生較多活性氧，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲，同時外界有毒物質(zhì)也進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[5]，對植物的正常發(fā)育(如蛋白質(zhì)和葉綠素的合成等)造成較大的傷害[6].面臨銅脅迫的環(huán)境，耐銅植物自身進(jìn)化出了一套保護(hù)系統(tǒng)，即抗氧化系統(tǒng)，由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及抗壞血酸還原酶(APX)組成，這些抗氧化酶通過清除代謝過程所產(chǎn)生的活性氧，將植物的活性氧含量維持在相對安全的范圍[7].

本文利用不同濃度的重金屬Cu(0、50、150、300和500 mg/L)對采自礦區(qū)東川和非礦區(qū)麗江、不同性別的中華山蓼進(jìn)行為期一個月或兩個月的處理，檢測了中華山蓼的抗氧化系統(tǒng)的各項酶指標(biāo)，主要包括SOD、POD、CAT、APX.此外還檢測了處理后植株的蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)及Cu2+含量等，以了解中華山蓼受重金屬Cu脅迫后的一系列生理變化,為后續(xù)該物種的持續(xù)利用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年4月，分別在東川和麗江隨機(jī)選擇中華山蓼幼苗，標(biāo)記幼苗的性別，然后采集地下根并用濕苔蘚包好帶回云南師范大學(xué).將中華山蓼幼苗的根部用剪刀剪切成5～10 cm的長度，將其分別種植在規(guī)格一致的花盆內(nèi)，并做好標(biāo)記.花盆內(nèi)均裝有相同質(zhì)量的珍珠巖和腐殖土混合土，實驗開始之前正常澆水，確保中華山蓼的生長，直至長出新葉.所有的幼苗在溫室中培養(yǎng)，溫室溫度和濕度等環(huán)境影響因素和外界一致.

1.2 試驗設(shè)計

使用土培的方法，Cu脅迫因子來自CuSO4.用3.91 g硫酸銅加入1 L蒸餾水制備濃度為1 g/kg的Cu2+溶液，再按照相應(yīng)比例稀釋為50、150、300及500 mg/kg的濃度，同時設(shè)置空白對照.Cu2+采用逐層噴灑和翻土混合的形式加入，脅迫實驗開始之后，定期定量進(jìn)行澆水.每個濃度水平不同地區(qū)不同性別分別種有10株中華山蓼植株，處理一個月以后取5株中華山蓼植株，剩余5株在兩個月以后取樣.取樣后進(jìn)行生理指標(biāo)和Cu2+含量的檢測.

1.3 測定方法

抗氧化系統(tǒng)中酶含量(SOD、POD、CAT和APX)的測定參考Gossett[8]、Beauchamp和Fridovich[9]、Tatiana[10]、Aebi[11]及Nakano[12]等人.丙二醛(MDA)參考TBA法，可溶性蛋白參考G250法，脯氨酸(Pro)參考茚三酮測定法測定，葉綠素含量參考丙酮萃取法測定，Cu2+含量參考ICP-OES測定[13].

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel整理原始數(shù)據(jù)，再利用R軟件包對其進(jìn)行Box-Cox轉(zhuǎn)換，并對轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 中華山蓼各項酶活性指標(biāo)對重金屬Cu脅迫的響應(yīng)

2.1.1 超氧化物歧化酶

從表1可得，不同器官的SOD含量有顯著差異(P<0.05)，其他因素對SOD含量沒有顯著影響，表明中華山蓼不同器官對重金屬Cu的脅迫有不同響應(yīng).從圖1中看出，葉中SOD值顯著高于根，且SOD由根、莖、葉逐漸遞增.脅迫開始時，SOD最先做出響應(yīng)，開始清除活性氧自由基[14].根部最先接受重金屬脅迫且能累積較多重金屬，經(jīng)過莖的運(yùn)輸作用進(jìn)入植物葉片的Cu2+一部分會被植物自身所利用，一部分將會通過葉片揮發(fā)到外界，還有一部分留在植物體內(nèi)[15].雖然根中Cu2+含量較葉片多，但根部有較強(qiáng)的耐受性，能通過絡(luò)合及螯合等作用累積大量重金屬離子，減少脅迫壓力，而葉片耐受性較弱，大量Cu2+的進(jìn)入使其受脅迫程度較根部大，因此中華山蓼葉中SOD值顯著高于根.

表1不同因素對超氧化物歧化酶含量的影響
Table1 Effects of different treatments on the content of Superoxide Dismutase

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)1244.82244.820.080.7722性別13419.173419.171.180.2790處理時間11955.651955.650.670.4131濃度12404.232404.230.830.3642器官113998.3513998.354.860.0281

圖1 不同因素對超氧化物歧化酶含量的影響Fig.1 Effects of different treatments on the content of Superoxide Dismutase

2.1.2 過氧化物酶

從表2可以看出，不同處理時間和不同部位的POD值有顯著差異(P<0.05)，其他因素對POD的含量沒有顯著影響.從圖2可知，處理時間為一個月的POD值明顯比處理兩個月的高，而根的POD值明顯比葉高.POD能分解SOD作用后得到的H2O2，又能和SOD一樣消除自由基，兩者互補(bǔ)作用，維持植物體內(nèi)活性氧的平衡[16].當(dāng)植物受到脅迫時，產(chǎn)生大量的POD，在植物適應(yīng)脅迫后，活性自由基含量減少，所產(chǎn)生的POD也隨之減少，所以，處理時間為一個月的POD值顯著比處理兩個月的高.由2.1.1可知，SOD在葉片中含量較多，根中較少，可能由于SOD和POD互補(bǔ)作用的關(guān)系，根中POD的含量增加以彌補(bǔ)SOD含量的不足，維持植物體內(nèi)的活性氧自由基保持在相對穩(wěn)定的水平[17]，所以根中的POD顯著比葉中的高.

表2不同因素對過氧化物酶含量的影響
Table 2 Effects of different treatments on the content of Peroxidase

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.030.030.260.6104性別10.020.020.200.6523處理時間10.550.555.170.0236濃度10.110.111.050.3071部位10.650.656.100.0140

圖2 不同因素對過氧化物酶含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on the content of Peroxidase

2.1.3 過氧化氫酶

從表3可以看出，五個因素對中華山蓼植株中的CAT含量都沒有顯著影響(P>0.05，圖3).CAT的作用是和POD一起將SOD作用后所產(chǎn)生的H2O2分解為氧和水，可能POD的作用已能夠維持分解SOD作用后所得到的H2O2，從而使植物體內(nèi)活性氧自由基維持在相對安全的范圍內(nèi)，從而導(dǎo)致CAT的含量沒有顯著性差異.

表3不同因素對過氧化氫酶含量的影響
Table 3 Effects of different treatments on the content of catalase

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.000.000.270.6019性別10.000.000.360.5463處理時間10.000.000.900.3444濃度10.000.000.370.5410部位10.000.000.030.8599

圖3 不同因素對過氧化氫酶含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of catalase

2.1.4 抗壞血酸過氧化物酶

利用R軟件包對數(shù)據(jù)做Box-Cox處理后，地點(diǎn)、性別、處理時間和濃度四個影響因素均滿足方差分析要求，但不同器官的APX含量不滿足，對其進(jìn)行非參數(shù)檢驗，得出總體分布存在顯著差異(P<0.05).從表4可以看出，四種因素對APX值均沒有顯著影響(P>0.05，圖4).APX可使超氧自由基活性降低，清除葉綠體內(nèi)的H2O2，其含量沒有明顯差異的原因可能和CAT類似.

表4不同因素對抗壞血酸還原酶含量的影響
Table 4 Effects of different treatments on the content of ascorbate reductase

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.000.000.070.7869性別10.010.011.290.2569處理時間10.010.012.010.1569濃度10.000.000.120.7315

圖4 不同因素對抗壞血酸還原酶含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on the content of ascorbate reductase

2.2 中華山蓼的蛋白質(zhì)含量對重金屬Cu脅迫的響應(yīng)

利用R軟件包對數(shù)據(jù)做Box-Cox處理后，地點(diǎn)、性別、濃度和器官四個影響因素均滿足方差分析要求，但不同處理時間下不滿足，對其進(jìn)行非參數(shù)檢驗.不同處理時間的蛋白質(zhì)含量的總體分布不存在明顯差異(P>0.05)；從表5可以看出，不同器官的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，其余三個因素都不顯著，說明中華山蓼的不同器官(根、莖、葉)的蛋白質(zhì)含量對重金屬Cu的脅迫存在不同的響應(yīng).從圖5可以知，葉中蛋白質(zhì)含量明顯比根和莖低.植物在受到脅迫時，植物體內(nèi)會合成大量蛋白質(zhì)，用來螯合重金屬，降低其毒性，維持正常的細(xì)胞代謝[18].根部為最先接觸脅迫的一個器官，所以根部的蛋白質(zhì)含量最高.

表5不同因素對蛋白質(zhì)含量的影響
Table 5 Effects of different treatments on the content of proteins

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.000.000.120.7240性別10.000.000.380.5354濃度10.000.000.020.8911器官10.120.1210.680.0012

圖5 不同因素對蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on the content of proteins

2.3 丙二醛、脯氨酸和葉綠素含量

由于MDA、Pro及葉綠素含量僅在中華山蓼的葉片中開展了檢測，所以不存在不同器官這一影響因素.

2.3.1 丙二醛

利用R軟件包對數(shù)據(jù)做Box-Cox處理后，地點(diǎn)、性別和濃度三個因素均滿足方差分析要求，不同處理時間的MDA含量不滿足，對其進(jìn)行非參數(shù)檢驗，得出總體分布有明顯差異(P<0.05)；從表6可知，地點(diǎn)、性別和濃度三個因素對MDA的含量無明顯影響(P>0.05).MDA是衡量膜脂過氧化損害的指標(biāo)，MDA含量增加，細(xì)胞膜透性增大，最終導(dǎo)致細(xì)胞對重金屬的吸收增大，但本研究中不同處理濃度、不同取樣地點(diǎn)、不同性別及不同部位中華山蓼MDA的含量均不存在顯著性差異，表明其細(xì)胞膜沒有受到重金屬Cu的損傷，證明中華山蓼是一種耐銅的植物.雖然處理時間增長會造成MDA含量累積顯著提高的現(xiàn)象，但總體水平下，并未造成對中華山蓼植株的傷害.

表6 不同因素對MDA的影響Table 6 The effect of different factors on MDA

圖6 不同因素對MDA的影響Fig.6 The effect of different factors on MDA

2.3.2 脯氨酸

從表7得出，不同處理時間對Pro含量有明顯影響(P<0.01)，其他的因素均沒有.從圖7得出，時間為一個月的Pro含量極顯著高于兩個月的.Pro作為重要的調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，通常它在植物中含量不高，但當(dāng)植物處于脅迫下，其含量就會提高，但當(dāng)植物已經(jīng)能抵抗脅迫，確保植物內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，Pro含量隨之降低.

表7不同因素對Pro含量的影響
Table 7 Effects of different treatments on the content of Pro

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.090.090.010.9132性別18.778.771.140.2916濃度14.334.330.560.4602處理時間1174.77174.7753.040.0000

圖7 不同因素對Pro含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on the content of Pro

2.3.3 葉綠素含量

從表8可以看出，不同地點(diǎn)和不同時間對中華山蓼葉綠素值有明顯影響(P<0.05)，其他的因素均無影響.從圖8可以看出，東川的中華山蓼的葉綠素含量顯著高于麗江，處理時間為一個月的中華山蓼葉綠素含量顯著高于兩個月的.葉綠素的多少可直接反映出植物的生長情況，采集自東川礦區(qū)的中華山蓼對重金屬的耐受性較非礦區(qū)麗江的中華山蓼強(qiáng)，所以當(dāng)受到脅迫時，東川地區(qū)的中華山蓼的葉綠素含量顯著高于麗江地區(qū)的中華山蓼，隨著處理時間的增加，重金屬脅迫能影響葉綠素的合成，造成植物色素含量降低，因此，處理時間為一個月的葉綠素含量顯著高于兩個月的.

表8不同因素對葉綠素含量的影響
Table 8 Effects of different treatments on the content of chlorophyll

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)1235.59235.596.030.0187性別160.5560.551.390.2462濃度18.018.010.180.6755處理時間1228.55228.555.830.0207

圖8 不同因素對葉綠素含量的影響Fig.8 Effects of different treatments on the content of chlorophyll

2.4 不同處理下中華山蓼體內(nèi)Cu2+含量對重金屬Cu脅迫的響應(yīng)

利用R軟件包對數(shù)據(jù)做Box-Cox處理后，地點(diǎn)、性別、處理時間、濃度四個因素均滿足方差分析要求，不同器官的Cu2+含量不滿足，進(jìn)行非參數(shù)檢驗，得出總體分布是有明顯差異(P<0.05)；從表9可知，不同濃度和不同時間對中華山蓼的Cu2+含量有明顯影響(P<0.05)，其他因素的影響均不顯著.從圖9可得，時間為一個月的Cu2+含量顯著比兩個月的高，不同處理濃度下的Cu2+含量顯著比對照組高.其原因可能是：實驗初期，中華山蓼對Cu因子還未產(chǎn)生有效的應(yīng)對機(jī)制，當(dāng)植物受到一段時間的脅迫后，會外排或阻止重金屬Cu的吸收，還可以通過螯合、絡(luò)合作用來減少游離態(tài)金屬離子，所以處理時間不同，植物體內(nèi)Cu2+含量會有所差異.不同處理濃度下中華山蓼體內(nèi)Cu2+含量顯著高于對照組是必然結(jié)果.

表9不同因素對Cu2+含量的影響
Table 9 Effects of different treatments on the content of heavy Metal Cu

因素DfSumSqMeanSqFP地點(diǎn)10.000.000.060.8115性別10.000.000.810.3707處理時間10.000.00304.370.0000濃度10.000.004.990.0275

圖9 不同因素對Cu2+含量的影響Fig.9 Effects of different treatments on the content of Cu2+

3 討論與小結(jié)

在重金屬脅迫的環(huán)境下，植物體內(nèi)的活性氧累積會引起膜脂過氧化，最終破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能.植物體內(nèi)的抗氧化物酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT和APX)則可以清除植物體內(nèi)的活性自由基，保持體內(nèi)活性氧的平衡，使細(xì)胞膜不受活性氧的傷害[19].本研究中，SOD作為植物抵抗逆境脅迫的第一道防線，在中華山蓼對重金屬Cu的脅迫響應(yīng)中起到了重要的作用.該物種不同部位SOD的含量存在顯著性差異，葉中SOD含量顯著高于根，可能是由于根部有較強(qiáng)的耐受性,能通過絡(luò)合及螯合等作用累積重金屬離子，減少脅迫壓力，但葉片耐受性弱受脅迫程度大.POD在重金屬Cu脅迫中協(xié)助SOD消除活性氧，使植物體內(nèi)活性氧維持在穩(wěn)定水平.不同處理下CAT和APX對重金屬Cu的脅迫均沒表現(xiàn)出顯著差異響應(yīng)，導(dǎo)致這樣結(jié)果的原因可能是中華山蓼對重金屬Cu耐受性較強(qiáng)，POD和SOD的協(xié)同作用就能維持植物體內(nèi)的活性自由基的穩(wěn)定.

重金屬離子在植物體內(nèi)與其他化合物結(jié)合成金屬絡(luò)合物或螯合物，導(dǎo)致植物代謝活動受到抑制尤其是蛋白質(zhì)的合成[20].因此，可溶性蛋白的多少可以直觀地反映出植物是否受到脅迫的傷害.從圖5得出，中華山蓼不同部位(根、莖、葉)的可溶性蛋白質(zhì)含量有顯著差異，根系可溶性蛋白含量顯著比莖和葉高，莖的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于葉片，表明根對Cu的耐受性最強(qiáng).

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，因此其含量是植物在逆境條件下受害程度的體現(xiàn).游離脯氨酸的功能是能調(diào)節(jié)滲透平衡、抵制超氧自由基所產(chǎn)生的傷害作用及加強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定程度，類似于可溶性蛋白.葉綠素的含量和植物光合作用的速率有著直接的聯(lián)系，而光合作用又是提供植物生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源的重要環(huán)節(jié)[21-22].從圖6-8可知，在重金屬Cu脅迫下，不同處理下MDA含量均沒有明顯差異，表明Cu2+對植物的傷害程度較低，也驗證了中華山蓼對重金屬Cu有較高的耐受性.不同處理時間下中華山蓼的Pro和葉綠素含量對重金屬Cu的脅迫均表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，時間為一個月的Pro和葉綠素含量均顯著比第二個月高.Pro的作用是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透壓，只有在受到脅迫的時候其含量會增加，當(dāng)中華山蓼適應(yīng)脅迫環(huán)境之后，Pro又降低到一個正常水平.重金屬Cu脅迫能影響葉綠體中的類囊體薄膜，高濃度的銅能使葉綠素酶失活，加速葉綠體的分解，從而導(dǎo)致葉綠素合成受到影響.本研究發(fā)現(xiàn)來自東川礦區(qū)的中華山蓼的葉綠素含量顯著高于麗江地區(qū)，可能是由于東川的中華山蓼長期處于礦區(qū)的脅迫環(huán)境下，其葉綠素的合成已適應(yīng)了重金屬Cu脅迫.

總之，中華山蓼對重金屬Cu脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力，主要表現(xiàn)在SOD和POD的含量差異，而抗氧化系統(tǒng)中其他的酶可能并未參與到耐受脅迫過程中；而受重金屬脅迫后植物常見的蛋白質(zhì)含量和Pro含量升高、葉綠素含量降低現(xiàn)象，在中華山蓼中僅表現(xiàn)為蛋白質(zhì)含量的增加，進(jìn)一步證明了中華山蓼對重金屬Cu脅迫的耐受能力.此外，在重金屬Cu的脅迫下，來自礦區(qū)(東川)的中華山蓼比非礦區(qū)(麗江)的植株具有更強(qiáng)的耐受性，主要表現(xiàn)在葉綠素含量的差異，表明東川礦區(qū)的中華山蓼對重金屬Cu脅迫的適應(yīng)能力較強(qiáng)，可能已經(jīng)形成獨(dú)特的遺傳資源.因此，在開展礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)時，中華山蓼可作為備選植物之一，而生長在礦區(qū)的中華山蓼植株可作為礦區(qū)植被恢復(fù)的重要種質(zhì)資源.