郎繁繁，楊文飛，閆裕峰，田 莉*，梁 楷

（1.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400；

2.山西省食品工業(yè)研究所，山西 太原 030024）

山西是全國聞名的老陳醋發(fā)源地，山西老陳醋因其蒸、酵、熏、淋、陳的傳統(tǒng)工藝，以及集酸、綿、甜、香、鮮于一體的風味特征，位于四大名醋之首。不僅聞名全國，而且蜚聲海外[1]。

傳統(tǒng)的山西老陳醋生產(chǎn)采用手工固態(tài)釀造工藝[2]，隨著科技的不斷進步，越來越多的食醋釀造企業(yè)開始將機械化生產(chǎn)設(shè)備融入傳統(tǒng)工藝中，實現(xiàn)了從原料到產(chǎn)品完全機械化生產(chǎn)[3]。然而在改進工藝設(shè)備的同時也需要對原有的質(zhì)量控制體系做出相應(yīng)的調(diào)整，以在進行工藝創(chuàng)新的同時，保障產(chǎn)品質(zhì)量。危害分析和關(guān)鍵控制點（hazard analysis critical control point，HACCP）體系是國際上共同認可和接受的食品安全保證體系，其可以通過控制食品生產(chǎn)過程中關(guān)鍵點有效保護食品免受可能發(fā)生的危害[4-7]。目前已有部分學者對HACCP在食品工業(yè)中的應(yīng)用進行了研究，李秀鳳等[8-9]探究了食醋釀造過程中HACCP體系的建立，王建萌等[10]已對鎮(zhèn)江香醋的質(zhì)量安全控制體系做出了研究，但還鮮有關(guān)于HACCP在山西老陳醋機械化生產(chǎn)中的應(yīng)用研究。

山西紫林醋業(yè)股份有限公司是最早實現(xiàn)山西老陳醋的機械化釀造的一批企業(yè)之一，本文結(jié)合其機械化釀造工藝，對山西老陳醋機械化生產(chǎn)進行關(guān)鍵控制點（CCP）分析，確定山西老陳醋機械化釀造的關(guān)鍵控制點后，對各控制點進行工藝標準化研究，并著重介紹了對其中機械化程度較高的工藝優(yōu)化過程。旨在進一步推進山西老陳醋機械化釀造進程，保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性，提高山西老陳醋的市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、麩皮、谷糠、稻殼：市售；大曲：山西紫林醋業(yè)股份有限公司；葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：天津歐博凱化工有限公司；鐵氰化鉀：天津市光復精細化工研究所。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

STARER3100酸度計：奧豪斯科技有限公司；TU-1810紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Alkomat酒精檢測儀：福林斯生化技術(shù)有限公司；酒精發(fā)酵罐、醋酸發(fā)酵池、蒸汽熏醅罐：山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山西老陳醋機械化生產(chǎn)工藝流程及操作要點

在嚴格選用原料的基礎(chǔ)上，分別對酒精發(fā)酵階段、醋酸發(fā)酵和熏醅階段工藝參數(shù)進行優(yōu)化，酒精發(fā)酵階段大曲用量為62.5%（以高粱質(zhì)量計），總發(fā)酵周期14 d；醋酸發(fā)酵階段添加的輔料為按一定比例混合的麩皮、谷糠和稻殼，最高溫度可達48℃，發(fā)酵周期13～15d，拌入10%的食鹽（以高粱質(zhì)量計）結(jié)束醋酸發(fā)酵；淋醋條件為溫度90℃，醋醅與淋水量體積比1∶1.6，浸醅時間4.5 h；陳釀前進行煎煮滅菌，陳釀12個月以上，采用超高溫瞬時滅菌：121℃、15s后灌裝。

1.3.2 檢測分析方法

酒精度的測定：將酒醪過濾后采用福林斯酒精檢測儀直接檢測；淀粉的測定：采用酸水解法[11]；總酸的測定：取10 g醋醅加入90 mL水浸泡3 h后過濾，按照國標GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》[12]中的方法進行測定；新醋中總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、可溶性無鹽固形物、總酯等理化指標及微生物指標按GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》[13]規(guī)定的方法測定；褐色度的測定[14-16]：準確量取10.00 mL不同熏醅工藝參數(shù)下形成的醋樣，4 000 r/min離心后，以蒸餾水作為參比調(diào)零，利用分光光度計在波長420 nm處測定各樣品吸光度值A(chǔ)420nm，以A420nm對褐色度的大小進行評價。

1.3.3 HACCP關(guān)鍵控制點確定

在建立HACCP體系時，先遵循HACCP體系基本原理進行危害分析[17-20]，確定其中會對終產(chǎn)品造成顯著影響的工序作為關(guān)鍵控制點。

1.3.4 酒精發(fā)酵階段工藝參數(shù)優(yōu)化

表1 酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for alcohol fermentation process optimization

結(jié)合山西老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝的參數(shù)[21]，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酒精發(fā)酵結(jié)束時酒醪酒精度為評價指標，對酒精發(fā)酵初始淀粉含量、入罐溫度和糧水比3個影響因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，各因素及試驗水平見表1。

1.3.5 醋酸發(fā)酵階段工藝參數(shù)優(yōu)化

以醋酸發(fā)酵結(jié)束時醋醅總酸含量為評價指標對醋酸發(fā)酵階段工藝條件進行優(yōu)化，醋酸發(fā)酵階段各因子及水平設(shè)計見表2，其中密度為疏松狀態(tài)即正常發(fā)酵狀態(tài)下新醅密度，為表述方便，麩皮∶谷糠∶稻殼（以高粱質(zhì)量計）以輔料配比表示，進行優(yōu)化設(shè)計。

表2 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for acetic fermentation process optimization

1.3.6 熏醅階段工藝參數(shù)優(yōu)化

熏醅結(jié)束后其褐色度可以很好地反應(yīng)熏醅程度[15]，因此以熏醅的褐色度為評價指標，對熏醅工序罐內(nèi)溫度、醋醅占熏醅罐體積（添加量）及熏醅總時間進行了優(yōu)化，各因素及水平設(shè)計如表3。

表3 熏醅工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface methodology for fumigation process optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 HACCP關(guān)鍵控制點確定

遵循HACCP體系基本原理判定以下工序作為山西老陳醋機械化釀造工藝的關(guān)鍵控制點，判斷依據(jù)見表4。

在陳釀和灌裝前均設(shè)置滅菌步驟，以防止在陳釀期間由于微生物的代謝造成營養(yǎng)物質(zhì)的損耗，以及殺滅終產(chǎn)品中致病菌，如果滅菌條件控制不當，會使產(chǎn)品中有致病菌殘留。在進行危害分析時確定這兩處滅菌工序為關(guān)鍵控制點。新工藝這兩處滅菌均采用超高溫瞬時滅菌進行滅菌不僅使得產(chǎn)品安全可靠，而且最大程度上保留了產(chǎn)品營養(yǎng)價值。結(jié)合山西紫林醋業(yè)股份有限公司機械化生產(chǎn)工藝，針對機械化程度最高的酒精發(fā)酵階段、醋酸發(fā)酵階段和熏醅階段進行工藝參數(shù)優(yōu)化。

表4 關(guān)鍵控制點判斷依據(jù)Table 4 Judgment data of critical control point

2.2 酒精發(fā)酵階段工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 酒精發(fā)酵階段初始條件優(yōu)化

對酒精發(fā)酵階段影響因子進行響應(yīng)面試驗，通過Design-Expert8.0.6進行設(shè)計和分析，響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果如表5。

表5 酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments foralcohol fermentation process optimization

采用Design-Expert.V8.0.6對表5中試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y（酒精度）和各因子之間的回歸方程：

Y=24.93A-1.81B+41.04C+7.50×10-3AB-0.07AC+0.05BC-0.88A2+0.02B2-5.08C2-221.59

對該模型進行方差分析，方差分析結(jié)果見表6。由表6可知，模型的P＜0.000 1，R2=0.984 5，R2adj=0.964 5，表明該模型極顯著，與實際試驗的擬合關(guān)系良好，失擬項（P=0.797 8＞0.05）不顯著，表明模型具有很好的可靠性，可以用來分析和預(yù)測山西老陳醋酒精發(fā)酵工藝條件。

表6 酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface experiments results for alcohol fermentation process optimization

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，作初始淀粉含量、入罐溫度、糧水比對酒精發(fā)酵結(jié)束后酒醪酒精度交互作用影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖1。

以酒精度最大值為目標進行優(yōu)化，得到酒精發(fā)酵階段最佳發(fā)酵條件為：初始淀粉含量14.08%，入罐溫度28.00℃，糧水比1∶4.08（kg∶kg），酒醪酒精度理論值可達到9.27%vol，結(jié)合實際生產(chǎn)調(diào)整為初始淀粉含量14%，糧水比1∶4（kg∶kg）后進行驗證試驗，得到酒醪酒精度為9.15%vol，與預(yù)測值 接近，證明優(yōu)化所得酒精發(fā)酵階段工藝參數(shù)具有可行性。

圖1 各因素交互作用對酒精度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol contents

2.2.2 酒精發(fā)酵階段跟蹤試驗

利用優(yōu)化得出的山西老陳醋酒精發(fā)酵階段最佳工藝參數(shù)，跟蹤檢測酒精發(fā)酵過程中酒精度的變化趨勢，確定主發(fā)酵時間；跟蹤檢測后發(fā)酵期總酯[21]含量變化趨勢確定酒精發(fā)酵周期，并跟蹤不揮發(fā)酸含量變化作為參考。

圖2 酒精發(fā)酵階段跟蹤試驗Fig.2 Follow-up study of alcohol fermentation process

由圖2可知，在酒精發(fā)酵階段，酒醪酒精度在前3天變化顯著，3 d后變化趨勢趨于平緩，因此確定主發(fā)酵時長為3 d，3 d后封閉發(fā)酵罐，進入后發(fā)酵階段，在后發(fā)酵階段酒醪中總酯含量開始大量積累，發(fā)酵14 d后酒精、總酯和不揮發(fā)酸含量變化不明顯，因此選擇酒精發(fā)酵總周期為14 d。

2.3 醋酸發(fā)酵階段工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 醋酸發(fā)酵階段初始條件優(yōu)化

對醋酸發(fā)酵階段影響因子進行響應(yīng)面試驗，通過Design-Expert.V8.0.6進行試驗設(shè)計和分析，試驗設(shè)計和結(jié)果如表7。

表7 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments for acetic acid fermentation process optimization

對表7中試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y（總酸含量）和各因子之間的回歸方程：

Y=291.48A-10.63B+5.26C+1.20AB-19.00AC+0.60BC-269.60A2+

1.34 B2+0.90C2-54.34

對該模型進行方差分析，方差分析結(jié)果見表8。由表8可知，模型的P＜0.000 1＜0.01，R2=0.983 1，R2adj=0.961 3，表明該模型極顯著，與實際試驗的擬合關(guān)系良好，失擬項P=0.1728＞0.05，不顯著，表明模型具有很好的可靠性，可以用來分析和預(yù)測山西老陳醋酸發(fā)酵工藝條件。

表8 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments results for acetic acid fermentation process optimization

續(xù)表

來源 平方和 自由度 平均方差 F值 P值（Prob＞F）顯著性AB AC BC A2 B2***C2 5E-02 2 2E-01 3E+01 7 7E-02 0.830 4 0.201 9 0.670 0 0.001 4 0.037 8 0.792 2殘差失擬項純誤差總和2E-04 9E-03 9E-04 1E-01 3E-02 3E-04 3E-02 2E-02 1E-02 2 1 1 1 1 1 1 7 3 4 2E-04 9E-03 9E-04 1E-01 3E-02 3E-04 5E-03 7E-03 3E-03 30.172 8 2E+01

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件作醋醅密度、初始酒精度、輔料配比對醋酸發(fā)酵結(jié)束后醋醅總酸含量交互作用影響的響應(yīng)面及等高線見圖3。

在建立了醋醅總酸含量與各因素的相關(guān)性模型后，以醋醅總酸含量最大值為目標進行優(yōu)化，得到醋酸發(fā)酵階段最佳發(fā)酵條件為新醅密度0.53 t/m3，初始酒精度4.48%vol，麩皮∶谷糠∶稻殼1∶0.96∶0.44（kg∶kg∶kg），醋醅總酸理論值可達到5.95 g/100 g，結(jié)合實際生產(chǎn)調(diào)整初始酒精度為4.5%vol，輔料配比為麩皮∶谷糠∶稻殼為1∶1∶0.4（kg∶kg∶kg）后進行驗證試驗，得到醋醅總酸含量為5.90 g/100 g，與預(yù)測值接近，證明優(yōu)化所得醋酸發(fā)酵階段工藝參數(shù)具有可行性。

圖3 各因素交互作用對總酸含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on total acid contents

2.3.2 醋酸發(fā)酵階段跟蹤試驗

采用優(yōu)化得到的醋酸發(fā)酵階段最佳工藝條件進行醋酸發(fā)酵，跟蹤檢測醋醅中總酸、總酯含量和酒精度變化來確定醋酸發(fā)酵周期，結(jié)果見圖4。

圖4 醋酸發(fā)酵階段跟蹤試驗Fig.4 Follow-up study of acetic acid fermentation process

由圖4可知，醋酸發(fā)酵進行到第13天，酒精度不再下降，醋醅總酸含量達到最大值，第14天開始呈現(xiàn)出下降趨勢，總酯含量在第13天也趨于穩(wěn)定，表明在第13天就需要向醋醅中加鹽結(jié)束醋酸發(fā)酵。

2.4 熏醅階段工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 熏醅階段工藝參數(shù)優(yōu)化

通過Design-Expert.V8.0.6對熏醅階段影響因子進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和分析，試驗設(shè)計和結(jié)果如表9，回歸模型方差分析見表10。

表9 熏醅工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 9 Design and results of Box-Behnken experiments for fumigation process optimization

表10 熏醅發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of response surface experiments results for fumigation process optimization

采用Design-Expert.V8.0.6對表9中試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y（褐色度）和各因子之間的回歸方程：

Y=0.11A+0.04B+0.06C+7.5×10-5AB+1.88×10-4AC+6.25×10-5BC-4.68×10-4A2-4.18×10-4B2-2.61×10-3C2-7.85

由表10可知，模型的P＜0.0001，R2=0.9877，R2adj=0.9719，表明該模型極顯著，與實際試驗的擬合關(guān)系良好，失擬項（P=0.1103＞0.05）不顯著，表明模型具有很好的可靠性，可以用來分析和預(yù)測山西老陳醋機械化熏醅工藝條件。在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，作溫度、添加量和熏醅時間對熏醅結(jié)束后褐色度交互作用影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對褐色度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on brown degree

在建立了褐色度與各因素的相關(guān)性模型后，給定一個較高[15-16]的褐色度值1.05為目標值進行優(yōu)化，得到最佳熏醅條件為溫度118.57℃，添加量占熏醅罐體積68.34%，熏醅時間12.54 h，熏醅褐色度理論值為1.05，結(jié)合實際生產(chǎn)，調(diào)整熏醅條件為溫度120℃，添加量70%，熏醅時間12h的條件下進行驗證試驗，得到熏醅褐色度為1.00，與預(yù)測值接近，證明優(yōu)化所得熏醅階段工藝參數(shù)具有可行性。

2.4.2 熏醅階段跟蹤試驗

采用優(yōu)化得到的最佳熏醅工藝條件熏醅后，對醋醅中川芎嗪含量的變化進行跟蹤檢測，結(jié)果見圖6。

圖6 熏醅階段跟蹤試驗Fig.6 Follow-up study of fumigation process

由圖6可知，在熏醅條件為溫度120℃，添加量占熏醅罐體積70%的條件下，醋醅中川芎嗪含量在12 h之前不斷升高，12 h之后開始呈現(xiàn)出下降趨勢，可見選擇優(yōu)化出的工藝條件進行熏醅還可同時得到高含量的川芎嗪[13]。

2.5 工藝驗證

采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)，控制山西老陳醋關(guān)鍵控制點進行山西老陳醋的生產(chǎn)，取在太陽能陳釀池中陳釀完成后的終產(chǎn)品檢測各項理化指標，并與GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋》中的要求進行對比，依照比較結(jié)果擬定企業(yè)內(nèi)部生產(chǎn)遵循的質(zhì)量標準，結(jié)果如表11。

由表11可知，在采用優(yōu)化工藝進行生產(chǎn)，得到的山西老陳醋產(chǎn)品各項理化指標均優(yōu)于國標要求，衛(wèi)生指標也均達標，不僅質(zhì)量安全可靠，而且營養(yǎng)價值高。同時，結(jié)合實際生產(chǎn)擬定了優(yōu)于國標要求的公司內(nèi)部質(zhì)量標準嚴格控制出廠產(chǎn)品，進一步保障產(chǎn)品質(zhì)量。

表11 山西老陳醋中各項理化指標測定結(jié)果Table 11 Determined results of physical and chemical indexes in Shanxi aged vinegar

3 結(jié)論

對山西老陳醋機械化釀造工藝關(guān)鍵控制點進行CCP分析，確定原料采購、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏醅、淋醋、滅菌等工序為關(guān)鍵控制點。要求原料采購階段提供檢驗報告、抽樣檢測，拒絕無合格證明的原輔料。酒精發(fā)酵階段控制初始淀粉含量14%，入罐溫度28 ℃，糧水比1∶4（kg∶kg），主發(fā)酵時間3 d，期間每天進行通氣攪拌，之后進行密封發(fā)酵，總發(fā)酵周期14天。醋酸發(fā)酵階段控制初始醋醅密度0.53t/m3，初始酒精度4.50%vol，麩皮∶谷糠∶稻殼1∶1∶0.4（kg∶kg∶kg），每天通過翻醅機翻醅一次，醋酸發(fā)酵至第13天向醋醅中加鹽并翻勻。熏醅溫度120℃，添加量占熏醅罐體積70%，熏醅時間12h。淋醋溫度90℃，醋醅與淋水量體積比1∶1.6（m3∶m3），浸醅時間4.5 h。陳釀前滅菌：煎煮滅菌，煮沸30 min；灌裝前滅菌：超高溫瞬時滅菌：121℃，15 s。在該控制標準下釀造生產(chǎn)的食醋各項指標均可達到國標要求。