趙現(xiàn)華,李翠霞,2,李 華*
(1.泰山學院 生物與釀酒工程學院,山東 泰安 271021;
2.山東農(nóng)業(yè)大學 園藝科學與工程學院,山東 泰安 271018;
3.西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌 712100;
4.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西 楊凌 712100)
葡萄酒中富含多糖、多酚、氨基酸、各種微量元素、維生素、有機酸,長期飲用葡萄酒有益于健康,可以降低癌癥、心腦血管的發(fā)病,延緩衰老[1]。葡萄酒中適度的有機酸可以增強醇厚感,是葡萄酒的骨架之一,但葡萄中的有機酸含量過高(尤其是蘋果酸),會給人一種酸澀粗糙的感覺,此類葡萄酒尤其是干紅葡萄酒選擇合適的降酸方式顯得非常重要[2-3]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF)是葡萄酒釀造過程中的二次微生物發(fā)酵,在乳酸菌的作用下,將L-蘋果酸(二元酸)轉化成L-乳酸(一元酸),并且釋放出CO2,能降低葡萄酒的酸度,提高pH值,豐富葡萄酒的香氣,增強細菌的穩(wěn)定性,提高葡萄酒的質量[2,4]。酒酒球菌(Oenococcusoeni)由于可以較好地適應葡萄酒中的惡劣環(huán)境(低pH,高酒精和SO2)和產(chǎn)生較低含量的生物胺,成為進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的最穩(wěn)定乳酸菌之一[5]。
葡萄酒生產(chǎn)過程中,MLF的進行是在酒精發(fā)酵(alcoholic fermentation,AF)后或自發(fā)或人為接種商業(yè)乳酸菌進行,即順序蘋果酸-乳酸發(fā)酵(sequential MLF,SEQ),以防止產(chǎn)生過量乙酸[6]。然而,酒精發(fā)酵后由于酵母代謝產(chǎn)生的乙醇和中鏈脂肪酸等物質的存在往往會抑制酒酒球菌的生長,致使MLF產(chǎn)生對葡萄酒感官質量有不良影響的副產(chǎn)物,甚至是MLF不能正常啟動[7]。同時將酵母和細菌培養(yǎng)物接種到葡萄汁中,可以使細菌逐漸適應葡萄酒中的惡劣環(huán)境,這是一種緩解順序蘋果酸-乳酸發(fā)酵缺點的一種方法,簡稱為共發(fā)酵(simultaneous MLF,SIM)[8]。傳統(tǒng)上,為了避免乳酸細菌可能分解糖和其他葡萄酒成分,共發(fā)酵一般被阻止[2]。近年來,部分學者開始嘗試利用葡萄汁、荔枝汁和榴蓮汁進行共發(fā)酵[3,6,8-9]。共發(fā)酵可以縮短發(fā)酵時間,但由于細菌的快速生長,釀酒酵母和細菌之間的共發(fā)酵可能會抑制酵母的生長和代謝,導致產(chǎn)生過多的揮發(fā)性酸甚至終止酒精發(fā)酵[10]。順序發(fā)酵和共發(fā)酵的優(yōu)點和風險仍然存在爭議,特別是其對葡萄酒化學成分變化的影響方面。
該研究將共發(fā)酵與僅進行酒精發(fā)酵和順序發(fā)酵進行比較,對比不同發(fā)酵模式下蛇龍珠干紅葡萄酒的發(fā)酵動力學模型、化學成分的變化以及感官品質的差異,篩選出葡萄酒進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的可行新模式,為保留葡萄酒的特色風味,豐富葡萄酒的感官質量提供理論依據(jù)。
1.1.1 材料
蛇龍珠葡萄:新疆巴音郭勒州和碩地區(qū)。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Excellence XR,酒酒球菌(Oenococcus oeni)1:法國卓越集團。釀酒酵母和酒酒球菌發(fā)酵劑是以干粉的形式購買,根據(jù)供應商提供的產(chǎn)品說明書進行活化使用。
1.1.2 試劑
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基、MRS瓊脂和MRS肉湯培養(yǎng)基:海博生物科技有限公司。
葡萄糖、果糖、蔗糖、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙酸、琥珀酸標準品和揮發(fā)性物質定量標準參考化合物:美國Sigma-Aldrich公司。
BPC-70F型生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學儀器有限公司;LC-20A型高效液相色譜儀(配紫外檢測器)、GC/MS-QP2010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS):日本島津公司;固相微萃?。╯olid-phase microextraction,SPME) 手動進樣手柄57330-U、DVB/CAR/PDMS復合萃取頭(50/30μm):美國Supelco公司;AXTG16G型離心機:上海安亭科學儀器廠;pB-10型pH計:新銳儀表儀器有限公司。
1.3.1 葡萄酒發(fā)酵處理
挑選無霉爛的葡萄40 kg,完全除梗后手工破碎(破碎率30%),平均分配到9個5 L玻璃瓶中,加入SO2(50 mg/L),添加果膠酶(20 mg/L)處理2 h。在4℃條件下經(jīng)72 h冷浸后進行3種不同的發(fā)酵處理,即對照(CK,僅接種酵母菌進行酒精發(fā)酵)、順序發(fā)酵(SEQ,酒精發(fā)酵結束后接種酒酒球菌啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵)和共發(fā)酵(SIM,在酵母接種24 h后接種酒酒球菌啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵)[11]。
釀酒酵母干粉于37~40℃的5%蔗糖水中活化20~25 min,接種濃度為107CFU/mL;酒酒球菌干粉于20℃的5%蔗糖水中活化20~30 min,接種濃度為107CFU/mL,發(fā)酵溫度控制在18~20℃。分別在第0、2、5、8、12、16、21、26天取樣離心處理進行各種指標的測定,每個處理重復3次。
1.3.2 微生物計數(shù)
釀酒酵母菌細胞和酒酒球菌細胞計數(shù)均采用無菌生理鹽水(0.9%NaCl)梯度稀釋的方法進行。酵母菌細胞計數(shù):吸取100 μL無菌生理鹽水適當稀釋樣品涂布在PDA瓊脂培養(yǎng)基,于25℃好氧培養(yǎng)72 h后計數(shù)。酒酒球菌細胞計數(shù):吸取100 μL生理鹽水適當稀釋的樣品涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基,于28℃厭氧培養(yǎng)5~7d對酒酒球菌進行計數(shù)。
1.3.3 基本理化指標和有機酸化學組分分析
可溶性固形物:使用手持糖量計進行測定;酒精:采用密度瓶法測定;pH:通過酸度計測定[12]。有機酸、糖含量采用高效液相色譜法進行分析[13]。
1.3.4 揮發(fā)性成分分析
揮發(fā)性物質提?。簠⒄?BARBOSA C等[14]描述的方法,對葡萄酒的揮發(fā)性成分進行定性定量分析。向20 mL頂空小瓶中分別加入8 mL葡萄酒樣品、2 g氯化鈉和20 μL的2-辛醇(內(nèi)標物,814 mg/L)。在40℃條件下加熱攪拌萃取50 min后進樣,解吸10 min。
色譜條件:色譜柱為DB-Wax(60m×0.25mm×0.25μm);升溫程序:30℃保持2min,然后以6℃/min的速度升至130℃,以4℃/min的速度升至230℃,并在230℃保持8 min。載氣為氦氣(He),平均線速度為25 cm/s,無分流進樣。
質譜條件:火焰離子化檢測器(flame ionization detector,F(xiàn)ID)溫度為250 ℃,電子能量:70 eV;質量掃描范圍30~400 amu。
定性定量:通過美國國家標準與技術研究院(national institute of standards and technology,NIST)譜庫14和NIST 14S比較保留時間和質譜來對香氣化合物定性。使用溶解在模擬葡萄酒中的外部標準物(11%vol乙醇水溶液,酒石酸調pH至3.40)和2-辛醇作為原樣采用內(nèi)標法來對揮發(fā)性化合物進行定量,對于缺乏純參考標準的化合物,采用化學結構和碳原子數(shù)最大相似的原理進行量化。
1.3.5 感官分析
葡萄酒樣品的感官質量評價采用定量描述分析(quantitative descriptive analysis,QDA)的方法進行。品評組由11人組成,包括6名女性和5名男性,年齡為28~46歲。感官品評實驗在標準品酒室中進行,品酒室溫度23℃左右,通風條件良好,無雜物與異味。要求小組成員描述具有7種氣味類別(花香、果香、甜味、生青/酸、溶劑、脂肪和整體香氣)的葡萄酒香氣。并使用5分制來評估強度,其中1=非常弱,2=弱,3=中等,4=強,5=非常強。
1.3.6 統(tǒng)計分析
使用SPSS16.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,葡萄酒樣品之間的顯著差異通過方差分析和Duncan檢驗進行,模型在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。
葡萄酒的酒精發(fā)酵是在酵母菌的作用下,將糖發(fā)酵生成酒精,并釋放出CO2的過程。酵母菌數(shù)量在酒精發(fā)酵過程中的動態(tài)變化如圖1所示,在所有發(fā)酵模式(圖1A、1B、1C)中,釀酒酵母均能夠迅速適應葡萄酒的環(huán)境,迅速增長。隨著發(fā)酵的進行,酵母菌生長需要的必要營養(yǎng)成分不斷減少,同時產(chǎn)生了抑制釀酒酵母生長的抑制劑—乙醇,導致酵母菌數(shù)量降低[15]。尤其在SIM過程中,由于酒酒球菌的接入,酵母菌的數(shù)量迅速降至5.5×108CFU/mL(圖1B),在一定程度上影響了酵母菌的生長。這與釀酒酵母的種類和酒酒球菌的種類也直接有關[2]。
圖1 蛇龍珠葡萄酒不同發(fā)酵模式CK(A)、SIM(B)、SEQ(C)中微生物數(shù)量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of microbial quantity in different fermentation modes CK(A),SIM(B)and SEQ(C)of wine
酒酒球菌的接入需要經(jīng)過2 d對葡萄酒環(huán)境的適應才能快速生長,順序發(fā)酵模式中在第8天接入酒酒球菌進行MLF降酸實驗。酒酒球菌細胞數(shù)在接入后的第8天達到最大約8×107CFU/mL,然后保持穩(wěn)定。而SIM中,酒酒球菌的數(shù)量在接入后的第5天達到最大約8×107CFU/mL,然后保持穩(wěn)定(圖1B、圖1C)。研究結果表明,共發(fā)酵過程中的發(fā)酵環(huán)境更易于酒酒球菌生長,縮短MLF進程[16]。
在酒精發(fā)酵過程中,酵母菌和乳酸菌之間存在著拮抗作用,這種拮抗作用主要是通過酵母對營養(yǎng)的競爭和分泌抑菌物質來實現(xiàn)的[2]。酵母菌在酒精發(fā)酵過程中消耗掉發(fā)酵基質中絕大部分的精氨酸和其他氨基酸,而這些氨基酸又是酒酒球菌生長所需的重要營養(yǎng)物質。同時酵母菌產(chǎn)生的乙醇也能抑制甚至殺死葡萄酒乳酸菌。酵母生長繁殖過程中產(chǎn)生的拮抗因子(如辛酸和癸酸等)對乳酸菌的生長也有抑制作用。酵母菌與乳酸菌的拮抗作用也因種間關系有所不同。卵形酵母(S.oviformis)能強烈拮抗腸膜明串珠菌(Leuc.mesenteroides)、希氏乳桿菌(L.hilgardii)和短乳桿菌(L.brevis)。在酒精發(fā)酵前,發(fā)酵汁中的畢赤酵母(Pichia)和路氏類酵母(Saccharomycodes)的增殖能夠強烈抑制乳酸菌的生長。另一方面,酵母的代謝和自溶作用卻可以刺激乳酸菌的生長。酵母菌生長過程中產(chǎn)生的維生素及氨基酸有利于乳酸菌的生長。酵母的自溶作用可以提高葡萄酒中氨基酸水平,刺激乳酸菌的生長。
葡萄汁和不同發(fā)酵葡萄酒中部分理化指標的變化見表1。由表1可知,所有發(fā)酵模式中可溶性固形物的含量從22.04°Bx持續(xù)下降至約5.00°Bx,并保持穩(wěn)定;不同處理中蔗糖、果糖和葡萄糖均無顯著差異(P>0.05),這主要與微生物對糖的利用能力有關。所有處理的葡萄酒乙醇含量(12.42%vol~12.50%vol)沒有顯著差異,這與TANIASURI F等[3]的研究結果一致。但JUSSIER D等[8,17]利用乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)酵母的生長和發(fā)酵活性出現(xiàn)嚴重的抑制現(xiàn)象甚至是酒精發(fā)酵中止。由表1可以看出,SEQ和SIM處理均能使葡萄酒中的蘋果酸含量降低至1 g/L以下,其中SIM處理的蘋果酸降低更加迅速。在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中,L-蘋果酸進入細胞,同時被蘋果酸-乳酸酶脫羧產(chǎn)生L-乳酸和CO2,然后反應產(chǎn)物離開細胞。由于底物和產(chǎn)物的差異導致介質的堿化,形成質子動力,促使細胞膜ATP酶合成ATP,維持乳酸菌的生長。在葡萄酒生產(chǎn)中,不能讓乳酸菌分解糖和其他葡萄酒成分,應該盡快地使糖和蘋果酸消失,以縮短酵母菌和乳酸菌繁殖或這兩者同時繁殖的時期[2]。
對照CK、SEQ和SIM中葡萄酒的pH值分別從最初的3.59逐漸升高至3.63、3.85、3.79,這一結果符合葡萄酒進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵后pH值增加0.1~0.3單位的理論值,pH的降低主要由于MLF發(fā)酵后蘋果酸的降解所致。但不同處理中有機酸組分差異較大(表1)。不同處理間蘋果酸、乳酸、檸檬酸含量變化差異顯著(P<0.05),SEQ和SIM中蘋果酸的含量顯著低于對照CK(P<0.05)。葡萄酒中蘋果酸的大量減少和乳酸的大量增加主要歸因于MLF,而對照組CK中蘋果酸的降低和乳酸的少量產(chǎn)生是由于釀酒酵母對L-蘋果酸的代謝或被動擴散所致[18]。此外,O.oeni還可以通過糖的異源代謝和檸檬酸代謝產(chǎn)生乳酸[19]。MLF后乙酸含量顯著增加(表1)主要是因為O.oeni可以通過糖的異源發(fā)酵或者檸檬酸途徑消耗檸檬酸來生產(chǎn)乙酸[19]。
表1 葡萄汁和不同方式發(fā)酵葡萄酒中部分理化指標變化Table 1 Changes of main physicochemical indexes in grape juice and wine with different fermentation modes
由表1可知,在所有發(fā)酵過程均發(fā)現(xiàn)酒石酸減少的現(xiàn)象。乳酸菌可以通過多種途徑對葡萄酒和葡萄汁中的有機酸進行代謝,當葡萄酒的pH值高于3.5時,有些乳酸菌(包括短乳桿菌、植物乳桿菌和片球菌中的個別菌株)能夠分解酒石酸,導致葡萄酒中的揮發(fā)酸含量增加。在蘋果菌-乳酸發(fā)酵過程中,只形成一種乳酸,即L-乳酸。當乳酸菌分解其他任何葡萄酒構成成分時都會同時產(chǎn)生L-乳酸和D-乳酸。在酒精發(fā)酵過程中,一些酵母菌亦可形成少量乳酸,特別是D-乳酸含量一般控制在200 mg/L以下[2]。本實驗過程中接種的乳酸菌為酒酒球菌,造成酒石酸減少的主要原因應該是酒石酸氫鉀的結晶析出所致[2]。
用HS-SPME-GC-MS/FID對葡萄酒中的各種揮發(fā)性物質進行定性和定量分析,結果見表2。由表2可知,共定性定量出39種揮發(fā)性成分,包括4種酸、9種醇、19種酯、5種醛酮類物質和2種其他類物質。SIM處理的葡萄酒中產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣總量最高,為48.08 mg/L,CK和SEQ處理的揮發(fā)性香氣總量分別為44.67 mg/L和47.97 mg/L。
表2 不同處理葡萄酒中主要揮發(fā)性成分分析Table 2 Analysis of main volatile components in wine with different treatmentsμg/L
由表2可知,高級醇是葡萄酒中的主要揮發(fā)性成分,適量的高級醇能夠增加葡萄酒風味的復雜性。實驗過程中有9種高級醇被定性定量,其中異戊醇含量最高,其次是2-甲基丙醇,1-癸醇含量最低。除2,3-丁二醇外,MLF顯著降低了SEQ和SIM處理的葡萄酒中所有高級醇的含量(P<0.05)。O.oeni可以通過MLF代謝檸檬酸產(chǎn)生雙乙酰,當雙乙酰濃度低于其閾值(5~7 mg/L)時,隨著濃度的增加對葡萄酒的香氣和感官質量起到積極作用,但當其含量高于閾值(5~7 mg/L)時,將會產(chǎn)生相反的結果[20]。在葡萄酒發(fā)酵過程辛酸、己酸、癸酸和2-甲基丁酸4種有機酸被定性定量,隨著發(fā)酵的進行總的有機酸酸濃度逐漸增加。除了辛酸外,MLF后葡萄酒中的有機酸含量均高于對照葡萄酒。其中SEQ中癸酸含量達到281.66 μg/L,是對照組的1.57倍,這可能是由微生物種類和水果品種不同導致的[21]。
酯類是葡萄酒中最主要的一類揮發(fā)性成分,對葡萄酒的香氣構成有著重要貢獻。大多數(shù)酯類物質是在酒精發(fā)酵過程中由釀酒酵母產(chǎn)生的,能賦予葡萄酒新鮮水果香氣。MLF過程中在乳酸菌酯酶的作用下,不同酯類物質的含量可能會增加或減少[22]。研究結果表明:3種葡萄酒中乙酸乙酯的含量均最高,其次是辛酸乙酯(表2)。各處理葡萄酒中壬醛,癸醛含量均無顯著差異(P>0.05)。與UGLIANO M等[23]的研究結果相似,MLF發(fā)酵增加了萜類化合物的含量,賦予了葡萄酒更多的果香和花香。實驗過程中有2種萜類化合物被定性定量,與對照CK相比,SEQ和SIM處理的葡萄酒中β-大馬酮含量增加顯著(P<0.05),分別達到15.52μg/L和13.16μg/L。SEQ和SIM處理的葡萄酒松油醇含量增加也達到差異顯著水平(P<0.05),分別為11.29μg/L和37.43μg/L。
采用定量描述分析法對不同處理葡萄酒樣品進行感官評價。本實驗由11名專業(yè)葡萄酒感官評定人員對葡萄酒的色澤、香氣以及口感等感官指標進行描述分析,并對各描述特征強度取均值,形成風味剖面圖(圖2)。品評結果表明,對照組產(chǎn)生的葡萄酒具有強烈的“生青”味,以及輕微的“花香”和“溶劑”的味道,略帶紫色色調。MLF使葡萄酒的口感在“酸”方面更加柔和,“酒體”更加飽滿。其中SIM處理獲得的葡萄酒色調突出,果香味明顯,這主要和發(fā)酵過程中乙酸乙酯、乙酸已酯、乙酸2-甲基丁酯和乙酸3-甲基丁酯含量增加有關。其口感入口舒順,口感柔和,酒體飽滿。而SEQ獲得的葡萄酒色澤略顯暗淡,雖然在一定程度降低了葡萄酒的生青味,但果香味較淡,口感柔和,酒體圓潤。
總體而言,MLF對葡萄酒的感官質量的提高發(fā)揮了巨大的作用。同時,釀酒酵母和酒酒球菌共接種獲得的葡萄酒大大提高了葡萄酒的酯類物質含量,賦予了葡萄酒豐富的香氣和獨特的風格特征。綜合而言,SIM獲得葡萄酒呈寶石紅略帶紫色色調,果香花香濃郁,入口柔順,酒體飽滿,風格獨特。
圖2 不同發(fā)酵模式葡萄酒的二次判別分析Fig.2 Quadratic discriminant analysis of wine with different fermentation modes
與傳統(tǒng)的順序發(fā)酵相比,釀酒酵母(S.cerevisiae)Excellence XR與酒酒球菌(O.oeni)1共發(fā)酵大大縮短了發(fā)酵時間,同時增強了葡萄酒中的花香和果香,豐富了葡萄酒的酒體,提高了葡萄酒的感官質量。因此,采用Excellence XR與酒酒球菌(O.oeni)1共接種具有明顯的優(yōu)勢,可以在葡萄酒釀造中推廣應用。