倪志華，張玉明*

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

乳酸是一種重要的有機(jī)酸，以乳酸為單體合成的聚乳酸生物塑料被認(rèn)為是石化塑料的最佳替代品之一，利用可再生生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸可實(shí)現(xiàn)資源綠色循環(huán)應(yīng)用[1]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，玉米秸稈資源豐富，利用玉米秸稈生物煉制乳酸，不但可以降低原料成本、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物綠色利用，而且可以解決秸稈丟棄、焚燒造成的環(huán)境污染問(wèn)題[2-3]。

微生物是生物煉制的主要參與者，根霉菌和乳酸細(xì)菌是研究最多的乳酸生產(chǎn)菌。劉占英等[4]對(duì)一株可直接降解纖維素生產(chǎn)乳酸的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）進(jìn)行紫外誘變育種，該菌株可利用玉米秸稈獲得0.63 g/L乳酸。李鑫等[5]以米根霉（Rhizopus oryzae）為菌種，生物轉(zhuǎn)化經(jīng)汽爆和堿處理后玉米秸稈酶解液（含有葡萄糖100 g/L），最終獲得69.15 g/L乳酸。對(duì)乳酸生物煉制過(guò)程優(yōu)化可降低生產(chǎn)成本，提高乳酸生產(chǎn)效率。王剛等[6]使用左旋乳酸芽孢桿菌W-1開展了玉米秸稈同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharificationandfermentation，SSF）產(chǎn)乳酸研究，在90g/L葡萄糖基質(zhì)中添加高溫蒸煮的玉米秸稈和纖維素酶300U/L，經(jīng)過(guò)6 d發(fā)酵可獲得72 g/L乳酸。陳曉佩等[7]對(duì)米曲霉進(jìn)行細(xì)胞固定化處理，將濃縮的玉米秸稈酸爆液（含有葡萄糖60 g/L）轉(zhuǎn)化為乳酸36.4 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率63.5%。

目前，利用秸稈生物煉制乳酸存在菌種適應(yīng)性差、原料利用率低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等技術(shù)難題，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[8]。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究以一株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為菌種，開展玉米秸稈生物煉制乳酸研究。借助該菌株高溫發(fā)酵、己糖/戊糖高效利用等特點(diǎn)，以期建立一種利用酸解玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乳酸新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈：采集于河北省保定市東金莊村農(nóng)田；纖維素酶（25FPU/mL）：寧夏夏盛集團(tuán)；β-葡萄糖苷酶（593CBU/mL）：丹麥諾維信公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖（純度均為99%），L-乳酸鈉（純度98%）：阿拉丁公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635（以下簡(jiǎn)稱菌株BCO）：本實(shí)驗(yàn)室保存。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BLBIO-7GC發(fā)酵罐：上海佰倫公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；MLS-3750全自動(dòng)滅菌鍋：日本三洋公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。1.3方法

1.3.1 菌株BCO混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

由于玉米秸稈等木質(zhì)纖維素水解液中可發(fā)酵糖類主要為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖[2]，本實(shí)驗(yàn)首先考察菌株BCO利用混合糖發(fā)酵乳酸能力。分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加總質(zhì)量濃度為60 g/L的混合糖，其中A組為20 g/L葡萄糖+33 g/L木糖+7g/L阿拉伯糖，B組為30g/L葡萄糖+25g/L木糖+5g/L阿拉伯糖。乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為50℃、100 r/min、pH 6.0。

1.3.2 玉米秸稈預(yù)處理和酶解實(shí)驗(yàn)

玉米秸稈洗凈、烘干、粉碎，過(guò)80目篩，以1∶8（mg∶L）的固液比置于2%硫酸溶液中，混勻后121℃濕熱處理90 min，5 000 r/min離心15 min獲得的上清液定義為酸水解液；離心獲得的沉淀使用水洗滌至中性，烘干至質(zhì)量恒定，定義為水不溶物（water insoluble solid，WIS）。將WIS用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.8）溶解，添加纖維素酶后在50℃、200r/min條件下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。為了避免酶解產(chǎn)物纖維二糖的抑制作用，酶解時(shí)加入20CBU/g纖維素的β-葡萄糖苷酶。

1.3.3 糖化發(fā)酵

將斜面培養(yǎng)的菌株BCO接種到含有20 g/L葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃、100 r/min培養(yǎng)6 h，制備BCO種子培養(yǎng)液。將干質(zhì)量為100g的玉米秸稈使用1.3.2方法進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的料液pH值調(diào)整為5.0后加入終濃度2%的酵母粉和BCO種子培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（接種量為5%）。當(dāng)料液中葡萄糖質(zhì)量濃度＜1.0g/L時(shí)，加入纖維素酶開啟SSF生產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)。當(dāng)發(fā)酵體系中乳酸濃度不再增加時(shí)，加入WIS粉末40 g和纖維素酶進(jìn)行補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)以提高產(chǎn)物乳酸濃度。SSF在發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為50℃、100 r/min、pH5.0。上述方法中纖維素酶添加量均為20 FPU/g纖維素。

1.3.4 測(cè)定方法

發(fā)酵液中糖和產(chǎn)物濃度：使用高效液相色譜儀測(cè)定[9]；玉米秸稈中纖維素含量：采用美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（nationnal renewable energy laboratory，NREL）推薦的方法測(cè)定[10]；L-乳酸含量：由生物傳感分析儀測(cè)定；發(fā)酵產(chǎn)物中L-乳酸的光學(xué)純度計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BCO對(duì)混合糖的利用

圖1 不同碳源比例對(duì)菌株BCO發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的影響Fig.1 Effect of different carbon source ratio on lactic acid productionby strain BCO

由圖1可知，當(dāng)使用A組碳源時(shí)，菌株BCO對(duì)葡萄糖和木糖的利用幾乎是同步的，發(fā)酵開始16 h后，碳源耗盡；使用B組碳源時(shí)，菌株BCO首先利用葡萄糖，再利用木糖和阿拉伯糖，發(fā)酵過(guò)程持續(xù)到20 h時(shí)碳源耗盡。這種優(yōu)先利用葡萄糖，再依次利用其他碳源的現(xiàn)象，稱為碳源代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效應(yīng)[11]。CCR效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重降低混合糖利用速度，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。因此，針對(duì)解除CCR效應(yīng)的研究工作有很多報(bào)道，涉及菌種遺傳改造[12]和發(fā)酵策略設(shè)計(jì)[13]。本研究顯示，菌株BCO在利用混合糖時(shí)存在CCR效應(yīng)，并且糖濃度比例變化也會(huì)影響菌株的糖利用模式。使用A組碳源和B組碳源所獲得產(chǎn)物乳酸的終質(zhì)量濃度分別為（50.54±1.42）g/L和（51.04±1.23）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為（0.92±0.02）g/g和（0.93±0.02）g/g。該結(jié)果說(shuō)明，BCO能夠同型發(fā)酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產(chǎn)乳酸，且具備高溫發(fā)酵特點(diǎn)，非常適合SSF工藝。

2.2 利用玉米秸稈酸水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

通常木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理后產(chǎn)生糠醛、乙酸等副產(chǎn)物會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，甚至?xí)绊懫鋵?duì)底物的轉(zhuǎn)化效率[14]。

玉米秸稈經(jīng)預(yù)處理，所得玉米秸稈稀酸水解液中含有混合糖（葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L）和一定量的發(fā)酵抑制物（乙酸（2.01±0.12）g/L，甲酸（0.04±0.01）g/L，糠醛（0.02±0.01）g/L，5-羥甲基糠醛（0.03±0.02）g/L）。由圖2可知，由于料液中存在一定量的抑制物，接種開始8h后菌株BCO才開始利用其中的糖基質(zhì)生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵24h后獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為（0.93±0.02）g/g。表明菌株BCO對(duì)玉米秸稈酸水解液中混合糖實(shí)現(xiàn)了同型乳酸發(fā)酵，且預(yù)處理產(chǎn)生的副產(chǎn)物未對(duì)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生明顯影響。

圖2 菌株BCO發(fā)酵玉米秸稈酸水解液生產(chǎn)乳酸Fig.2 Production of lactic acid from corn stalk acid hydrolysate by strain BCO

2.3 玉米秸稈WIS的纖維素酶解

使用100g玉米秸稈酸解后獲得WIS的干質(zhì)量為（58.72±2.16）g，以其為底物考察纖維素酶添加量對(duì)酶解效率的影響（固液填充比率為5.87%），酶解結(jié)果見表1。

表1 纖維素酶添加量對(duì)酶解效率的影響Table 1 Effect of cellulase addition on enzymatic hydrolysis efficiency

由表1可知，隨著纖維素酶添加量的增加，酶解時(shí)間不斷縮短，并且酶解產(chǎn)物葡萄糖的質(zhì)量濃度也逐漸升高。纖維素酶添加量達(dá)到20 FPU/g時(shí)，酶解時(shí)間縮短至30 h，酶解產(chǎn)物葡萄糖的質(zhì)量濃度增至22.26 g/L；繼續(xù)增加纖維素酶添加量，酶解時(shí)間及酶解產(chǎn)物變化不大。因此綜合酶解效率和纖維素酶成本考慮，20 FPU/g纖維素酶+20 CBU/g β-葡萄糖苷酶是玉米秸稈WIS的最佳酶用量，此時(shí)玉米秸稈WIS的酶解效率為（63.54±2.03）%。該結(jié)果也說(shuō)明2%硫酸預(yù)處理方法可以使玉米秸稈中纖維素充分暴露，被纖維素酶水解。

2.4 菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

菌株BCO具備纖維二糖的利用能力[9]，因此SSF過(guò)程無(wú)需額外添加β-葡萄糖苷酶，菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過(guò)程曲線見圖3。

圖3 菌株BCO利用玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過(guò)程曲線Fig.3 Curve of lactic acid production from corn stalk by strain BCO with solid-state fermentation

由圖3可知，由于酶解作用，發(fā)酵體系中葡萄糖和纖維二糖濃度迅速增高。但是隨著菌株BCO的生長(zhǎng)，葡萄糖和纖維二糖逐漸被轉(zhuǎn)化為乳酸，酶解產(chǎn)物抑制被有效緩解。葡萄糖和纖維二糖是纖維素酶解的兩個(gè)最重要抑制物，菌株BCO可將上述兩種碳源發(fā)酵生成乳酸，不僅提高了SSF效率，并且可降低纖維素酶使用量[15-16]。在發(fā)酵開始65 h后，料液中基質(zhì)幾乎消耗完全，乳酸含量為（38.38±1.03）g/L。此時(shí)100 g玉米秸稈生物轉(zhuǎn)化得到乳酸（40.19±1.22）g，L-乳酸光學(xué)純度為（99.23±0.22）%。與其他中溫菌SSF發(fā)酵過(guò)程相比，BCO生長(zhǎng)溫度與商品纖維素酶最佳活力溫度相一致，纖維素酶的活性得到全部發(fā)揮，因此發(fā)酵過(guò)程更為高效[8]。乳酸生物煉制時(shí)，受限于原料預(yù)處理填充率問(wèn)題，不能獲得高濃度的糖，因此產(chǎn)物乳酸濃度偏低[17]。針對(duì)此問(wèn)題，有研究使用汽爆[18]等高效的原料預(yù)處理方法或者改進(jìn)纖維素酶解工藝，可獲得到高濃度的可發(fā)酵糖類[19]。當(dāng)然，進(jìn)行SSF發(fā)酵時(shí)采用補(bǔ)料工藝也可獲得濃度產(chǎn)物[20-21]。本研究在SSF發(fā)酵進(jìn)行至65 h時(shí)和100 h時(shí)，分別補(bǔ)加了玉米秸稈WIS干粉40g和纖維素酶（補(bǔ)加量為20FPU/g纖維素）。由于補(bǔ)加了底物和酶，BCO進(jìn)行了“二次發(fā)酵”，玉米秸稈WIS酶解產(chǎn)物（葡萄糖和纖維二糖）被持續(xù)利用。發(fā)酵至135h后，產(chǎn)物乳酸含量達(dá)到（82.56±1.28）g/L。借助菌株BCO和工藝優(yōu)化，本研究建立的玉米秸稈生物煉制乳酸方法，可將原料酸解/酶解獲得的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖高效轉(zhuǎn)化生成乳酸，省去了料液脫毒和WIS與玉米秸稈酸解液分別發(fā)酵的多步工藝單元。

3 結(jié)論

凝結(jié)芽孢桿菌BCO具有高溫生長(zhǎng)，同型發(fā)酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產(chǎn)乳酸能力，是一株良好的乳酸生物煉制菌。本研究使用的2%硫酸預(yù)處理工藝可酸解100 g玉米秸稈生成葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L。以其為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，菌株BCO可發(fā)酵獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率（0.93±0.02）g/g。進(jìn)一步開展玉米秸稈SSF研究，原料經(jīng)酸水解后無(wú)需固液分離，調(diào)整pH值后以20 g/L酵母粉為氮源，添加纖維素酶20 FPU/g纖維素后發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，65 h后可獲得乳酸（38.38±1.03）g/L，其中L-乳酸光學(xué)純度為（99.23±0.22）%。為了提高產(chǎn)物濃度，向發(fā)酵體系補(bǔ)加玉米秸稈WIS和纖維素酶，最終獲得乳酸（82.56±1.28）g/L。