賈艷艷，劉莎莎，丁 軻，何 雷，余祖華，李 靜，郁 川，廖成水，程相朝，李銀聚，殷月蘭，張春杰*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng)471023；2.洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng)471023；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009)

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由ND病毒(ND virus，NDV)引起的一種急性和高度接觸性傳染病，而傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD病毒(IBD virus，IBDV)引起的一種急性傳染性免疫抑制病，常常造成感染雞群大量死亡或發(fā)病雞群產(chǎn)肉、產(chǎn)蛋等生產(chǎn)性能下降[1-2]。在我國(guó)，雞IBD與ND一直是困擾養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，針對(duì)這兩種疾病，傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗的應(yīng)用仍然是主要的防控措施，但病毒變異株、超強(qiáng)毒株和新毒株的流行，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗免疫效果降低[3-4]，因此研發(fā)防控ND和IBD的新型疫苗顯得尤為迫切。血凝素 -神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase，HN)是重要的囊膜蛋白，在NDV吸附侵入過(guò)程中發(fā)揮重要作用，VP2蛋白是IBDV的宿主主要保護(hù)性抗原。目前研究已證實(shí)HN蛋白和VP2蛋白是研制ND和IBD新型基因工程疫苗的靶基因[5-6]。

沙門(mén)菌是一類(lèi)宿主譜廣泛的兼性胞內(nèi)寄生菌，近年來(lái)大量研究報(bào)道減毒沙門(mén)菌活載體遞呈禽流感病毒(AIV)HA蛋白、NDV HN蛋白和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)N蛋白等病毒保護(hù)性蛋白可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而抵抗病毒的感染[7-9]。因此，減毒沙門(mén)菌活載體疫苗因其可口服、同時(shí)遞呈多個(gè)外源抗原及能夠誘導(dǎo)黏膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，已被廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病疫苗的研發(fā)[10-11]。沙門(mén)菌編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白(cAMP receptor protein)的crp基因和編碼環(huán)化腺苷酸合成酶的cya基因是沙門(mén)菌重要的毒力調(diào)節(jié)基因[12]，asd基因編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是沙門(mén)菌代謝過(guò)程中的一種重要酶[13]。國(guó)外大量研究表明缺失了crp和cya的沙門(mén)菌株毒力顯著降低，但仍具有良好的侵襲力[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了鼠傷寒沙門(mén)菌SL1344的crp和cya雙突變株的毒力顯著降低，可作為良好的口服疫苗載體[15]。因此，本研究以前期構(gòu)建的沙門(mén)菌基因缺失株SL1344ΔcrpΔcyaΔasd為載體，構(gòu)建了表達(dá) NDV HN和 IBDV VP2融合蛋白的重組減毒鼠傷寒沙門(mén)菌(S.Typhimurium)，以期為ND-IBD-鼠傷寒沙門(mén)菌病的三聯(lián)口服疫苗研制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料S.typhimurium標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株SL1344、 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd、 pMD18-T-VP2 和pMD18-T-HN均由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。pYA3493(asd+)及其宿主菌χ6097(araΔ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2::Tn10]thiф80 d/lacZΔM15)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。

DNA聚合酶、DNA回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker、X-Gal、IPTG及T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；生化鑒定試劑購(gòu)自杭州-天和微生物試劑有限公司；雞抗IBDV陽(yáng)性血清和雞抗NDV陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗雞IgG-HRP購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。1日齡健康三黃小公雞購(gòu)自河南省洛陽(yáng)市第一種雞場(chǎng)。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的NDV HN(JF343538)和IBDV VP2(AF508177)基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，在引物A2和A3的兩端加入柔性氨基酸linker，并在A1和A4的兩端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)(表1)。以上引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 重組菌 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)的構(gòu)建及鑒定 以pMD18-T-VP2和pMD18-T-HN為模板，分別擴(kuò)增HN及VP2基因片段，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)(Splicing overlap extension by PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)SOE-PCR)擴(kuò)增HN-VP2融合基因片段?；厥誋NVP2片段，由北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。將回收純化后的HN-VP2連接至質(zhì)粒pYA3493，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物序列

將 100 μL SL1344ΔcrpΔcyaΔasd感受態(tài)細(xì)胞與10 μL pYA-HN-VP2混勻，冰浴30 min后電轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管，加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h～3 h，取100 μL菌液涂布在LB固體平板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，利用引物A1/A4進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌株即為 重 組 菌 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)， 以下簡(jiǎn)稱(chēng)重組菌。

1.4 融合蛋白在減毒沙門(mén)菌中的表達(dá) 采用三氯乙酸(TCA)方法提取重組菌的分泌蛋白，分別以雞抗IBDV陽(yáng)性血清和雞抗NDV陽(yáng)性血清(1∶500)為一抗，兔抗雞IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，采用western blot分析融合蛋白的表達(dá)，同時(shí)設(shè)SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)為對(duì)照。

1.5 重組菌的表型及生化鑒定 將重組菌分別接種至不含二氨基庚二酸(DAP)的LB培養(yǎng)基、含乳糖(Lac)、蔗糖(Suc)、葡萄糖(Glu)、麥芽糖(Mal)、甘露醇(Man)、鼠李糖(Rha)、山梨醇(Sor)、木糖(Xyl)和阿拉伯糖(Ara)的相應(yīng)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察重組菌株的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行歐普氏試驗(yàn)(VP)、甲基紅試驗(yàn)(MR)和三糖鐵生化試驗(yàn)(H2S)，同時(shí)設(shè)SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)和野 生 株 SL1344 為 對(duì)照。

1.6 重組菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將重組菌接種于LB培養(yǎng)基中37℃震搖培養(yǎng)12 h～14 h，取1 mL菌液用PBS洗滌2次后接種至4 mL LB培養(yǎng)基中調(diào)整OD600nm值至0.01，37℃振搖培養(yǎng)，分別間隔1 h收集菌液，測(cè)定其OD600nm值，繪制其生長(zhǎng)曲線，同時(shí)設(shè)親本株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)和野生菌株SL1344為對(duì)照。

1.7 融合基因在重組菌中的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將重組菌連續(xù)傳70代。每隔10代利用引物A1和A4進(jìn)行PCR鑒定，分析pYA-HN-VP2在重組菌株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.8 重組菌對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn) 將重組菌的過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶20轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4 h后測(cè)定其OD600nm并調(diào)整至所需濃度。選取合適的稀釋度，每只200 μL口服感染雛雞，同時(shí)設(shè)置PBS組和野生菌SL1344組為對(duì)照，連續(xù)觀察30 d，記錄雛雞的死亡情況，并進(jìn)行Bliss分析測(cè)定重組菌對(duì)雛雞的LD50。

1.9 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2的構(gòu)建與鑒定 以pMD18-T-HN及pMD18-T-VP2為模板，PCR擴(kuò)增HN基因和VP2基因。以回收純化的HN及VP2基因片段為模板進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到約2 300 bp的融合片段(圖略)，測(cè)序鑒定結(jié)果顯示其與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2酶切鑒定結(jié)果顯示，單酶切結(jié)果得到5 500 bp的條帶，雙酶切分別得到約3 200 bp的載體條帶和2 300 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1)。表明重組質(zhì)粒pYA-HNVP2已正確構(gòu)建。

2.2 重組菌的PCR鑒定 將重組質(zhì)粒pYA-HNVP2電轉(zhuǎn)化至減毒沙門(mén)菌，對(duì)重組菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得了約2 300 bp的目的條帶(圖2)，與預(yù)期相符。表明獲得了重組菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)。

2.3 融合蛋白在重組菌中的表達(dá)及鑒定 收取重組菌 株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)和 SL1344 ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)的上清，分別進(jìn)行 western blot鑒 定 ， 結(jié) 果 顯 示 重 組 菌 株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)在84 ku處有明顯的目的條帶(圖3)，SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)則無(wú)目的條帶。表明該重組沙門(mén)菌可分泌表達(dá)HN-VP2融合蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物具有反應(yīng)原性。

2.4 重組菌的表型及生化鑒定 重組菌SL1344 ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)表型檢測(cè)結(jié)果顯示，該菌在不含DAP的LB平板上可以正常生長(zhǎng)，表明重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2可以產(chǎn)生DAP供給SL1344 ΔcrpΔcyaΔasd生長(zhǎng)。糖酵解試驗(yàn)結(jié)果顯示，該重組菌的生化特性與SL1344ΔcrpΔcyaΔasd基本一致，但與野生菌株SL1344相比，失去了利用麥芽糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖及木糖等的能力，這與CRP在碳源代謝產(chǎn)物抑制過(guò)程中起重要作用有密切關(guān)系[16]。而H2S、MR和VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組菌與野生菌株SL1344一致。

2.5 重組菌的生長(zhǎng)性能測(cè)定 對(duì)重組菌、缺失菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)及野生菌 SL1344 進(jìn)行生長(zhǎng)性能測(cè)定，結(jié)果顯示重組菌株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)與 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA)株的生長(zhǎng)速度基本保持一致，但慢于野生菌株(圖4)，表明cya和crp基因的缺失可能導(dǎo)致細(xì)菌攝取碳源減少[17]，從而顯著影響了鼠傷寒沙門(mén)菌的生長(zhǎng)速度。

2.6 重組菌的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將重組菌SL1344 ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)連續(xù)傳代，利用 PCR檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示其第10、20、30、40、50、60、70代的重組菌株均可以擴(kuò)增出約2 300 bp的目的條帶(圖5)，表明HN-VP2基因片段可以在重組沙門(mén)菌中穩(wěn)定遺傳。

2.7 重組菌對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn) 將重組菌口服感染雛雞后，連續(xù)觀察30 d，統(tǒng)計(jì)雛雞的死亡情況，結(jié)果顯示，通過(guò)Bliss方法計(jì)算野生菌株SL1344對(duì)雛雞的 LD50為 2.28×105cfu，而重組菌株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)口服感染最高劑量(4.57×1010cfu)的雛雞均未發(fā)生死亡，重組菌株的毒力較SL1344下降了至少5個(gè)對(duì)數(shù)單位(表2)。表明利用SL1344ΔcrpΔcyaΔasd構(gòu)建的重組菌株 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)更加安全。

表2 重組菌株對(duì)雛雞的LD50測(cè)定結(jié)果

3 討論

研究顯示減毒沙門(mén)菌經(jīng)口服免疫后可以定居在腸道相關(guān)淋巴組織，刺激抗原提呈細(xì)胞活化增殖，從而快速啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生特異性粘膜免疫、體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此其在眾多候選疫苗載體中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[18]。此外，沙門(mén)菌能夠同時(shí)表達(dá)多種外源抗原，可為開(kāi)發(fā)安全、廉價(jià)、便于使用的多價(jià)口服疫苗提供新思路。

ND和IBD是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的兩大動(dòng)物疫病。傳統(tǒng)疫苗雖然能降低ND的死亡率和發(fā)病率，但對(duì)目前流行株基因Ⅶ型NDV交叉保護(hù)力低，且存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，因此亟需研發(fā)與當(dāng)前流行株基因型匹配的NDV疫苗[4]。IBDV具有易變異、毒力返強(qiáng)的特點(diǎn)，大量研究表明傳統(tǒng)疫苗已不能阻斷IBDV新病毒株的傳播[19]。本研究將NDV HN基因和IBDV VP2主要抗原基因片段(99 bp～663 bp)[20]融合后，構(gòu)建了能夠分泌表達(dá)NDV HN和IBDV VP2融合 蛋 白 的 重 組 減 毒 沙 門(mén) 菌 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)。

質(zhì)粒平衡致死載體系統(tǒng)是解決外源質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的有效途徑[21]。asd基因編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中肽聚糖四肽尾的組成部分，asd突變株在無(wú)外源DAP條件下不能生存[22]。本研究將含asd基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pYA-HN-VP2導(dǎo)入鼠傷寒沙門(mén)菌SL1344的crp、cya、asd基因缺失株，表型鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的重組菌可以在不添加DAP的平板上正常生長(zhǎng)，表明重組菌與質(zhì)粒形成了質(zhì)粒平衡致死載體系統(tǒng)。該系統(tǒng)不但避免了抗生素選擇壓力，而且可以解決質(zhì)粒丟失及外源基因表達(dá)不穩(wěn)定等問(wèn)題，在臨床應(yīng)用中顯示出巨大優(yōu)勢(shì)。本研究中遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2)傳至第70代，仍可以穩(wěn)定遺傳重組質(zhì)粒pYA-HN-VP2。

為了保證融合基因編碼的蛋白質(zhì)正確折疊，活性互不影響，一般選擇富含疏水性的柔性氨基酸接頭(linker)連接融合基因。由這些氨基酸組成的接頭序列，活動(dòng)度較好，可以使各自蛋白折疊成天然構(gòu)象，保證生物學(xué)活性互不影響[23-24]。因此，為了獲取具有生物學(xué)活性的HN-VP2融合蛋白，本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在HN基因下游引物和VP2上游引物之間加入了氨基酸接頭(G-S-G-G-S-G)，然后通過(guò)SOEing PCR將HN基因和VP2基因進(jìn)行融合，并且western blot結(jié)果顯示分泌表達(dá)的融合蛋白HN-VP2具有良好的免疫反應(yīng)性。同時(shí)，毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示該重組減毒沙門(mén)菌 SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HNVP2)的毒力較野生株SL1344相比下降了至少5個(gè)對(duì)數(shù)單位，表明該重組減毒菌株安全性高，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)正確構(gòu)建了分泌表達(dá)HN-VP2融合蛋白的重組減毒沙門(mén)菌，安全性好，遺傳穩(wěn)定，重組菌株的免疫應(yīng)答能力和保護(hù)力效果評(píng)價(jià)需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。本研究為開(kāi)發(fā)ND和IBD的新型口服活載體候選疫苗株奠定重要基礎(chǔ)，又為雞ND和IBD和沙門(mén)菌病的防控提供新策略。