吳夢鴿，張睿，劉芮吟，費(fèi)繼敏，楊翠萍

650118 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 頭頸外二科(吳夢鴿、張睿、劉芮吟、費(fèi)繼敏)； 650223 昆明，中國科學(xué)院昆明動物研究所(楊翠萍)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種來源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，常發(fā)生于鼻咽頂后壁的頂部，以低分化鱗狀細(xì)胞癌和未分化癌最為常見[1]。中國人群的NPC發(fā)病率及死亡率明顯高于世界平均水平，目前以約全球20%的人口負(fù)擔(dān)全球NPC發(fā)病死亡的40%[2]，已成為頭頸腫瘤的主要癌種和病死因素[3]。由于該病具有發(fā)病部位隱匿、深在且侵襲、遷移能力強(qiáng)等組織生物學(xué)特性，故病變一般發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)完全切除困難，同步放化療是目前NPC的主要治療方式[4]。對于早期NPC，放療能有效改善患者的預(yù)后，但晚期患者常存在放療抵抗，超過20%的NPC患者在治療后最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者5年生存率僅為43.8%[5]。晚期NPC患者治療失敗等難題至今尚未找到全面解決的良策，故尋找與NPC治療和預(yù)后相關(guān)的新的分子標(biāo)志，對NPC的臨床防治具有重要意義。由基因ADH1B編碼的ADH1B蛋白是將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛的主要酶[6]。大量的證據(jù)表明，ADH1B基因的差異性表達(dá)有導(dǎo)致頭頸部腫瘤[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]等癌癥的風(fēng)險，但該基因在NPC中的研究甚少。本研究通過測定鼻咽癌細(xì)胞株以及正常的鼻咽上皮細(xì)胞株中ADH1B的mRNA表達(dá)量，并構(gòu)建鼻咽癌ADH1B過表達(dá)細(xì)胞系，利用生長曲線實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)來解析ADH1B對鼻咽癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，旨在為NPC的臨床治療提供新思路和靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析ADH1B在頭頸鱗癌中的表達(dá)情況

利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站GEPIA(http://gepia.cancer- pku.cn/)來進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)來源于癌癥和腫瘤基因圖譜(Cancer Genome Atlas，TCGA)。進(jìn)入網(wǎng)站，選擇用箱圖來顯示表達(dá)量，輸入基因?yàn)锳DH1B和腫瘤類型為HNSC，點(diǎn)擊分析獲得結(jié)果和P值。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化正常人鼻咽上皮細(xì)胞NP69、鼻咽癌細(xì)胞CNE- 1、CNE- 2、5- 8F、6- 10B均由中山大學(xué)腫瘤防治中心曾木圣研究員提供，HEK- 293T細(xì)胞由中國科學(xué)院昆明動物研究所腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室提供。其中CNE- 1、CNE- 2、5- 8F、6- 10B的培養(yǎng)基為補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO，10099141，澳洲)的RPMI- 1640培養(yǎng)基(CORNING，10- 040-CVR，美國)，NP69的培養(yǎng)基為補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM/F- 12培養(yǎng)基(CORNING，10- 092- CVR，美國)，HEK- 293T的培養(yǎng)基為補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM/High glucose培養(yǎng)基(CORNING，10- 013-CVRC，美國)。所有細(xì)胞的培養(yǎng)條件如下：溫度為37℃，并控制CO2濃度為5%。細(xì)胞長至80%～90%傳代。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

針對ADH1B設(shè)計過表達(dá)的質(zhì)粒，對照為pCDH空載體。將合成好的ADH1B的CDS區(qū)核苷酸序列目的片段連接至載體pCDH，抽取質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ(NEB，R3131，美國)和NotⅠ(NEB，R3189，美國)酶切鑒定，擴(kuò)增陽性目的質(zhì)粒。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將目的質(zhì)粒導(dǎo)入HEK- 293T細(xì)胞進(jìn)行病毒制備，病毒液用0.45 μM的濾膜 (Millipore，SLHV033RB，愛爾蘭)過濾后感染目的細(xì)胞CNE- 1、CNE- 2、5- 8F、6- 10B，使用polybrene (SantaCruz，sc- 134220，美國)促進(jìn)感染效率，用相應(yīng)濃度的嘌呤霉素(invivogen，ant- pr- 1，美國)篩選陽性細(xì)胞，擴(kuò)增并用RT- qPCR鑒定目的基因的過表達(dá)效率。

1.4 qRT- PCR

首先用Trizol法(AMBION，15596026，美國)抽提細(xì)胞總RNA，用超微量核酸蛋白測定儀(Nanodrop，ND2000，美國)測定RNA濃度，用PrimeScript反轉(zhuǎn)試劑盒(Takara，RR047A，美國)，在PCR儀(Biorad，T100，美國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Reverse Transcription- PCR，RT- PCR)，將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。然后在實(shí)時熒光定量PCR儀(Life，7500，美國)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔。熱循環(huán)參數(shù)如下：50℃，2min；95℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃ 1min，40×。

所用引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成，ADH1B的上下游引物分別為：5’- AAGGGGGCTGTTTATGGTG- 3’； 5’- GCCATCACGCCACAGTTTC- 3’。 β- actin的上下游引物分別為：5’- CATGTACGTTGCTA-TCCAGGC- 3’；5’- CTCCTTAATGTCACGCACGAT- 3’。

1.5 生長曲線

為測定細(xì)胞增殖能力，取對數(shù)期生長的細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行濃度測定。按照所需細(xì)胞數(shù)1.0×104/孔，用完全培養(yǎng)基配制相應(yīng)的細(xì)胞懸液按照1 mL/孔種至12孔板(NEST，712001，中國)，37℃、5% CO2培養(yǎng)6天；每天進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)濃度分別算出細(xì)胞數(shù)，繪制生長曲線。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

分別取一盤6孔板(NEST，703001，中國)中細(xì)胞生長狀態(tài)良好、細(xì)胞密度相近的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，用槍頭垂直劃痕并在0h拍照。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按12h、24h時間點(diǎn)取樣，拍照。將實(shí)驗(yàn)組和對照組所有圖片進(jìn)行對比，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。qRT- PCR和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，生長曲線采用重復(fù)測量資料的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。文中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 ADH1B在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)被抑制

為了明確ADH1B在NPC中的表達(dá)情況，我們首先在臨床腫瘤樣本中尋求基因表達(dá)譜的變化，目前已有的基因表達(dá)譜中沒有NPC臨床腫瘤組織中的數(shù)據(jù)，但是TCGA數(shù)據(jù)中ADH1B在519例HNSC患者樣本和44例正常樣本的表達(dá)的差異結(jié)果顯示，ADH1B在腫瘤樣本中比正常樣本低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。NPC作為頭頸腫瘤的主要癌種和病死因素，病理類型中90%為低分化鱗癌及未分化癌，推測ADH1B在NPC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。因此，我們分析了ADH1B在正常永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69及鼻咽癌細(xì)胞CNE- 1、CNE- 2、5- 8F、6- 10B中的相對mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，ADH1B的mRNA表達(dá)在所有鼻咽癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，分別下調(diào)了99.95%、99.94%、99.97%、99.96%(P<0.001，圖2)。

圖1ADH1B在頭頸鱗狀細(xì)胞癌及正常組織中的相對表達(dá)量 (*P<0.05)

Figure1.Relative Expression ofADH1Bin Head and Neck Squamous Cell Carcinoma and Normal Tissue

圖2 不同鼻咽癌細(xì)胞中ADH1B的相對mRNA表達(dá)

Figure 2. Relative mRNA Expression ofADH1Bin Different Nasopharyngeal Carcinoma Cell Lines

NP69(normalimmortalizednasopharyngealepithelialcells)andCNE-1,CNE-2,5-8F,6-10B(nasopharyngealcarcinomacells)wereincludedinanalysis.***P<0.001.

2.2 構(gòu)建ADH1B在鼻咽癌細(xì)胞中的過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

在鼻咽癌細(xì)胞中ADH1B表達(dá)被抑制的基礎(chǔ)上，構(gòu)建ADH1B過表達(dá)載體及對照載體pCDH，轉(zhuǎn)染HEK- 293T細(xì)胞包裝病毒后收上清感染鼻咽癌細(xì)胞系CNE- 1、CNE- 2、5- 8F、6- 10B，在1μg/mL的嘌呤霉素作用下，構(gòu)建了不同的鼻咽癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并用qRT- PCR方法驗(yàn)證了ADH1B過表達(dá)的效率(P<0.001，圖3)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四株鼻咽癌細(xì)胞均被過表達(dá)，分別過表達(dá)了9 766、1 757、1 032、3 987倍。

2.3 過表達(dá)ADH1B抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力

腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一是腫瘤細(xì)胞增殖出現(xiàn)異常，因此利用建立好的ADH1B穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系，通過生長曲線實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。生長曲線結(jié)果顯示，與對照組pCDH相比，過表達(dá)ADH1B組鼻咽癌細(xì)胞的增殖均受到了抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。第6天過表達(dá)ADH1B組的細(xì)胞數(shù)量分別是pCDH對照組的73.75%、70.87%、73.02%、71.52%。

圖3 RT- qPCR驗(yàn)證鼻咽癌細(xì)胞ADH1B過表達(dá)效率

Figure 3.Efficiency ofADH1B(Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line) Overexpression Verified by RT-qPCR

pCDHwassetascontrolgroup.***P<0.001.

圖4 過表達(dá)ADH1B抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力(*P<0.05，**P<0.01)

Figure 4.Proliferation of Nasopharyngeal Carcinoma CellsInhibited byADH1BOverexpression (*P<0.05,**P<0.01)

2.4 過表達(dá)ADH1B抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力

NPC的另一顯著特點(diǎn)即遷移能力強(qiáng)，因此，我們設(shè)計了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，通過比較同一時間點(diǎn)細(xì)胞愈合的面積，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ADH1B后鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力也明顯受到抑制(P<0.001，圖5)。其中CNE- 1細(xì)胞對照組24h劃痕創(chuàng)口面積為9.21%，過表達(dá)ADH1B的實(shí)驗(yàn)組劃痕創(chuàng)口面積為36.3%(P<0.001)；CNE- 2細(xì)胞對照組24h劃痕創(chuàng)口面積為18.1%，過表達(dá)ADH1B的實(shí)驗(yàn)組劃痕創(chuàng)口面積為45.4%(P<0.001)；5- 8F細(xì)胞對照組24h劃痕創(chuàng)口面積為27.2%，過表達(dá)ADH1B的實(shí)驗(yàn)組劃痕創(chuàng)口面積為44.6%(P<0.001)；6- 10B細(xì)胞對照組24h劃痕創(chuàng)口面積為25.1%，過表達(dá)ADH1B的實(shí)驗(yàn)組劃痕創(chuàng)口面積為41.2%。

圖5 過表達(dá)ADH1B抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力(***P<0.001)

Figure5.Migration of Nasopharyngeal Carcinoma Cells Inhibited byADH1BOverexpression (***P<0.001)

3 討 論

我國NPC的發(fā)病率和死亡率居世界首位，并且在老年人口中相對較高。鑒于我國社會人口老齡化的形勢將愈加嚴(yán)峻，未來NPC的發(fā)病率有可能還會持續(xù)上升[12]。同步放化療一直是NPC主要和首選的治療手段。早期NPC高度可逆，但局部治療失敗和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是晚期NPC患者不良預(yù)后的主要原因[13]。NPC的病因尚未完全明確，目前認(rèn)為NPC的發(fā)生是多因素的，為EB病毒(Epstein- Barr Virus，EBV)潛伏感染[14]、酒精、職業(yè)接觸粉塵以及吸煙等環(huán)境因素相互作用的多步驟發(fā)展過程。其中，酒精是NPC確定的危險因素[15-16]?；谧銐虻牧餍胁W(xué)證據(jù)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已經(jīng)將酒精飲料定義為“對人類致癌”類食品，如口腔癌、咽癌、喉癌、食道癌、肝癌、結(jié)直腸癌和女性乳腺癌等。

作為乙醇脫氫酶(ADH)家族的一員，ADH1B基因編碼I類ADH的β亞基，是組成功能性酶蛋白的主要亞基，ADH1B基因與其他人ADH基因(ADH4，ADH5，ADH6和ADH7)一起定位于染色體4q23[17]。ADH1B將乙醇代謝為乙醛，乙醛通過醛脫氫酶進(jìn)一步氧化成乙酸。如果累積超過一定閾值，乙醛可以與DNA嵌入形成致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的機(jī)會[18]。對ADH的研究開始于1937年首次從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中純化出ADH蛋白，以往對ADH1B的研究多集中在酒精代謝和飲酒行為等問題，在腫瘤的形成及發(fā)生發(fā)展中的研究相對較少。近年來，有研究者在多種腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)了ADH1B基因的差異表達(dá)對腫瘤有很大的影響[19]。Li等[20]通過一種新的方法- 交叉值關(guān)聯(lián)分析(Cross- Value Association Analysis，CVAA)研究發(fā)現(xiàn)，從Broadhos Institute的基因組數(shù)據(jù)分析鑒定腫瘤類型與腫瘤類型正常樣品之間差異表達(dá)的基因，ADH1B(排名第一)在幾乎所有癌癥類型中都被抑制，并且細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADH1B有抑制癌細(xì)胞的能力。Polimanti等[21]研究ADH1B分子途徑，發(fā)現(xiàn)ADH1B基因參與多種抗腫瘤藥物的代謝，包括異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺。Gharpure等[22]也在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)ADH1B的差異表達(dá)能使細(xì)胞分泌MMP- 7、CD- 26和組織蛋白酶來促進(jìn)癌癥進(jìn)展。

ADH1B在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中是否起到了一定作用目前仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ADH1B在HNSC患者樣本中顯著低表達(dá)，且ADH1B在鼻咽癌細(xì)胞中被下調(diào)，通過在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)ADH1B后，模擬正常細(xì)胞內(nèi)ADH1B蛋白的表達(dá)，可以顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性程度，提示ADH1B在NPC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要功能。因此，ADH1B在調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移中具有關(guān)鍵作用，或可作為NPC治療中的潛在治療靶標(biāo)或預(yù)測指標(biāo)。然而，ADH1B通過何種方式來影響鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，其上游及下游是否存在特異性的調(diào)控通路，目前尚未得知，需要收集大量的樣本進(jìn)行深入研究，結(jié)合其他因素進(jìn)行多指標(biāo)、多因素綜合分析，進(jìn)一步研究解析其作用機(jī)制。這將對NPC的臨床防治具有重要意義，并為NPC的防治開拓新思路和提供一定的理論意義和應(yīng)用價值。

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