劉靜　孫智路　周君　周桂娟　鐘培瑞　成果　王甜甜　鄧程遠(yuǎn)　廖瑛

【摘 要】目的：觀察關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶切斷后的關(guān)節(jié)不穩(wěn)導(dǎo)致的機(jī)械應(yīng)力改變引起的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的病理變化，為明確機(jī)械應(yīng)力失衡在骨關(guān)節(jié)炎致病中的重要作用提供依據(jù)。方法：將30只3月齡Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，每組15只。其中模型組手術(shù)切斷前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，術(shù)后12周，眼眶取血，頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)大鼠，對各組大鼠行關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin評分，對軟骨下骨Micro-CT及骨組織顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。采用血清酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP-5b）、骨源性堿性磷酸酶（BALP）、Ⅱ型膠原C端肽（CTX-Ⅱ）水平。結(jié)果：①模型組關(guān)節(jié)軟骨層變薄，軟骨表面破損，部分軟骨細(xì)胞核固縮，潮線紊亂，甲苯胺藍(lán)染色減少。模型組Mankin評分較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。②與對照組比較，模型組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度顯著降低，骨小梁分離度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。③模型組血清IL-1、IL-6、TRACP-5b、BALP、CTX-Ⅱ水平較對照組均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。結(jié)論：采用前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，可以成功復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型，模擬臨床膝骨關(guān)節(jié)炎的病理變化，關(guān)節(jié)不穩(wěn)所致的機(jī)械應(yīng)力失衡是導(dǎo)致創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的重要因素。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝;機(jī)械應(yīng)力;關(guān)節(jié)不穩(wěn);軟骨;軟骨下骨;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the pathological changes of articular cartilage and subchondral bone in rats with knee osteoarthritis caused by mechanical stress changes due to instability of intra-articular ligament after ligament transection，and to provide evidence for clarifying the important role of mechanical stress imbalance in the pathogenesis of osteoarthritis.Methods：Thirty three-month-old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into a control group and a model group，with 15 rats in each group.In the model group，the anterior and posterior cruciate ligaments and medial collateral ligaments were cut off.Twelve weeks after operation，orbital blood was collected and cervical dislocation was used to kill the experimental rats.Histopathological observation and Mankin score were made for articular cartilage of each group.Micro-CT of subchondral bone and quantitative analysis of bone microstructure were also made.Levels of IL-1，IL-6，TRACP-5b，BALP and CTX-Ⅱ were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：①In model group，the articular cartilage layer became thinner，the surface of cartilage was damaged，some chondrocyte nuclei were pyknosis，tidal line was disordered，and toluidine blue staining was decreased.The Mankin score of the model group was significantly higher than that of the control group（P < 0.01），the difference being statistically significant.②Compared with the control group，the bone volume fraction，trabecular number，and trabecular thickness obviously decreased and trabecular segregation decreased significantly in the model group，and the difference was statistically significant（P < 0.05 or P < 0.01）.③The levels of IL-1，IL-6，TRACP-5B，BALP and CTX-Ⅱ in the model group were significantly higher than those in the control group（P < 0.01）.Conclusion：By cutting the anterior and posterior cruciate ligaments and medial collateral ligaments，the model of knee osteoarthritis can be successfully reproduced and he pathological changes of clinical knee osteoarthritis can be simulated.The mechanical stress imbalance caused by joint instability is an important factor leading to traumatic osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis，knee;mechanical stress;joint instability;cartilage;subchondral bone;rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)楹诵?，累及軟骨下骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)周圍軟組織的慢性進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，隨著人口老齡化進(jìn)程，全球OA發(fā)病率高達(dá)4%～13%[2]，美國平均每年因OA而花費(fèi)的醫(yī)療費(fèi)用約2654億美元[3]。目前，OA治療效果有限，且具有高發(fā)病率、高致殘率、高耗費(fèi)的特點(diǎn)，所以研究OA的病理過程及影響因素，從機(jī)制上尋求防治方案至關(guān)重要，理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與選擇是研究OA發(fā)病機(jī)制及防治措施的必要手段。本研究采用關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶切斷導(dǎo)致大鼠膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，模擬OA受機(jī)械應(yīng)力改變刺激，觀察膝骨關(guān)節(jié)的軟骨及軟骨下骨的改變，闡明機(jī)械應(yīng)力失衡在KOA發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠30只，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SYXK（湘）2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，12 h間隔照明，自由飲水及進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，生產(chǎn)批號分別為ab100768、ab100772];骨源性堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP-5b）（武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號分別為SEB091Ra、SEA902Ra）;Ⅱ型膠原C端肽（CTX-Ⅱ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法試劑盒（廣州皓躍生物科技有限公司，生產(chǎn)批號7E2B2C3）;光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;微型離心機(jī)（BMJ，BMJ0826）;Micro-CT（廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠隨機(jī)分為對照組和模型組，每組15只。所有大鼠采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛以0.3 mL·（100 g）-1劑量腹腔注射麻醉，模型組采用關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶切斷進(jìn)行動(dòng)物造模：于雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做皮膚切口，打開關(guān)節(jié)囊，切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，徹底止血，逐層縫合，常規(guī)消毒包扎。對照組僅切開雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚，不打開關(guān)節(jié)囊，表皮縫合。術(shù)后允許大鼠自由活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠處置嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

2.2 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo) 術(shù)后12周，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛以0.3 mL·（100 g）-1劑量對所有大鼠腹腔注射麻醉。

2.2.1 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin評分 頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取左側(cè)脛骨粗略觀察外觀，固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中，進(jìn)行脫鈣、脫水、浸蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察各組關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)改變，并進(jìn)行Mankin評分。Mankin評分細(xì)則[4]如下：軟骨結(jié)構(gòu)（0分，正常;1分，表面不規(guī)則;2分，血管翳形成和表面不規(guī)則;3分，裂隙進(jìn)入過渡層;4分，裂隙進(jìn)入輻射層;5分，裂隙進(jìn)入鈣化層;6分，結(jié)構(gòu)完全破壞）。軟骨細(xì)胞（0分，正常;1分，彌漫性細(xì)胞過多;2分，局部細(xì)胞過多;3分，細(xì)胞過少）。軟骨基質(zhì)染色（0分，正常;1分，輕度減少;2分，中度減少;3分，重度減少;4分，未著色）。潮線完整性（0分，完整;1分，被血管破壞）。得分越高病變程度越重。觀察過程均在病理學(xué)專家指導(dǎo)下完成。

2.2.2 Micro-CT及骨組織顯微結(jié)構(gòu)分析 取右側(cè)脛骨近端，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，后放置于Micro-CT的檢測工作槽中。Micro-CT的掃描參數(shù)：旋轉(zhuǎn)角保持220°，增量0.6°，分辨率為45.0 μm，曝光時(shí)間為3000 ms，每層的具體間距為16 μm。每個(gè)標(biāo)本可獲取約200張圖像。并對軟骨下骨骨組織進(jìn)行定量分析，分析參數(shù)：骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

2.2.3 血清IL-1、IL-6、TRACP-5b、BALP、CTX-Ⅱ測定 眼眶取血，采用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，測定血清IL-1、IL-6、TRACP-5b、BALP、CTX-Ⅱ水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin評分 對照組軟骨表面光整，軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細(xì)胞排列有序，基質(zhì)染色均勻。模型組關(guān)節(jié)軟骨層變薄，軟骨表面破損，部分軟骨細(xì)胞核固縮，潮線紊亂。模型組Mankin評分較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1、表1。

3.2 Micro-CT及骨組織顯微結(jié)構(gòu)比較 與對照組比較，模型組BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著降低，Tb.Sp顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2、表2。

3.3 2組血清IL-1、IL-6、TRACP-5b、BALP、CTX-Ⅱ水平比較 模型組血清IL-1、IL-6、TRACP-5b、BALP、CTX-Ⅱ水平均較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

4 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，其發(fā)病及進(jìn)展由雌激素、衰老、炎癥因子、創(chuàng)傷、局部生物力學(xué)異常等多種因素共同作用引起[5]。研究結(jié)果顯示，軟骨、軟骨下骨、半月板之間的應(yīng)力失衡伴隨著KOA發(fā)生、發(fā)展的全程[6]。膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定除了依賴脛股關(guān)節(jié)面的骨性構(gòu)造以外，還有賴于前、后交叉韌帶，內(nèi)、外側(cè)副韌帶的制約以及拮抗肌的力量均衡[7]。在膝關(guān)節(jié)的力學(xué)平衡中，韌帶作為力的承受和傳遞組織發(fā)揮重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，韌帶切斷后軟骨損傷發(fā)生率明顯增高，損傷程度隨著病程延長而加重，而韌帶的修復(fù)可減緩軟骨的退變，并減輕軟骨細(xì)胞的凋亡[8]。研究表明，膝關(guān)節(jié)內(nèi)收力矩每增加1°，KOA的病情進(jìn)展加快6倍[9]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，糾正異常生物力學(xué)的方法如韌帶修復(fù)、膝關(guān)節(jié)矯形器等均可以明顯降低或延緩KOA的發(fā)生和發(fā)展[10]。關(guān)節(jié)軟骨在不平衡的機(jī)械應(yīng)力刺激下，將力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物學(xué)信號，促進(jìn)細(xì)胞表型基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞外基質(zhì)的代謝等，并最終導(dǎo)致OA的發(fā)生[11]。OA軟骨下骨壓力相關(guān)基因的高表達(dá)，引起骨量的重新分配和骨結(jié)構(gòu)的重新安排，證實(shí)了機(jī)械應(yīng)力是OA的致病因素，并有可能成為OA的早期干預(yù)靶點(diǎn)[12]。

前交叉韌帶切斷是OA常用的造模方法，能模擬OA的病理變化過程，但對手術(shù)者解剖知識掌握要求較高。Hulth法切除內(nèi)側(cè)半月板加內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶形成膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，從而誘發(fā)OA改變，成模效果顯著;但關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，且半月板切除過程中有破壞軟骨可能，影響模型的可靠性和穩(wěn)定性[13]。

早期診斷是治療OA的關(guān)鍵，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，大量研究表明，OA患者血清中的細(xì)胞因子如IL-1[14]、IL-6[15]及特異性生物標(biāo)志物CTX-Ⅱ[16]、TRACP-5b、BALP[17]等可早于組織學(xué)改變，及時(shí)反映OA的病理變化，并與OA的嚴(yán)重程度呈正比，對OA的早期診斷及療效評估具有重要意義。

本研究采用前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)機(jī)械應(yīng)力不均衡，同時(shí)改變了關(guān)節(jié)的力學(xué)軸線，形成軟骨退變的起始環(huán)節(jié)。與對照組比較，模型組膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色顯示關(guān)節(jié)軟骨層變薄，軟骨表面破損，部分軟骨細(xì)胞核固縮，潮線紊亂，具有較高的Mankin評分。細(xì)胞外基質(zhì)的代謝產(chǎn)物CTX-Ⅱ及炎癥指標(biāo)IL-1、IL-6水平明顯升高，提示關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變、細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)存在，符合OA的典型病理改變[18]。

在OA的發(fā)展過程中，早期骨吸收大于骨形成，局部骨質(zhì)疏松，為代償生物力學(xué)性能下降，軟骨下骨反應(yīng)性增生;隨著疾病的進(jìn)展，軟骨下骨出現(xiàn)明顯的軟骨下骨硬化、骨贅形成[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清BALP、TRACP-5b水平明顯高于對照組，而骨組織顯微結(jié)構(gòu)定量分析顯示，模型組大鼠骨組織的BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著降低，Tb.Sp明顯增高（P < 0.01）。說明模型組Tb.N及連接密度下降，分離度增加，存在骨質(zhì)疏松現(xiàn)象，Micro-CT圖像也直觀地反映出模型組軟骨下骨骨小梁稀疏，排列紊亂。提示關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶切斷12周后實(shí)驗(yàn)大鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)化加快，此時(shí)骨吸收大于骨形成，局部骨質(zhì)疏松，處于OA的早期階段。

綜上所述，以前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶切斷能建立穩(wěn)定的、理想的大鼠KOA模型，展現(xiàn)出與人OA相似的病理過程，且造模過程簡單，易操作，值得進(jìn)一步研究應(yīng)用。

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收稿日期：2019-01-12;修回日期：2019-04-25