張孟丹，梁俊平，張 靜，許振山，李 慧，張建新，聶國(guó)興

(河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

鯉(Cyprinuscarpio)是我國(guó)重要的淡水魚(yú)養(yǎng)殖品種之一，2017年全國(guó)產(chǎn)量達(dá)300.43萬(wàn)t，占全國(guó)魚(yú)類總產(chǎn)量的11.82%[1]。近年來(lái)，魚(yú)粉、豆粕等蛋白質(zhì)原料價(jià)格的上漲給鯉的養(yǎng)殖成本帶來(lái)巨大壓力，尋求廉價(jià)適宜的蛋白質(zhì)原料已成為解決鯉養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一[2-3]。我國(guó)棉粕資源豐富，年產(chǎn)量達(dá)600萬(wàn)t，棉粕中蛋白質(zhì)含量為46%～53%，與魚(yú)粉和豆粕中的蛋白質(zhì)含量相近，是水產(chǎn)飼料中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一[4-6]。但棉粕中含有的游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收，同時(shí)對(duì)動(dòng)物也具有一定毒性，從而限制了棉粕的廣泛使用[7-8]。

在草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)幼魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著棉粕替代魚(yú)粉比例的升高，草魚(yú)的特定生長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)替代比例達(dá)到60%(含游離棉酚68.28 mg/kg)時(shí)，草魚(yú)的特定生長(zhǎng)率顯著下降[9]。有研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加1 200 mg/kg醋酸棉酚，投喂大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)幼魚(yú)11周后，其特定生長(zhǎng)率和體質(zhì)量增加率顯著下降[10]。蔣春琴等[11]以含醋酸棉酚300 mg/kg的飼料投喂異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)8周后，其特定生長(zhǎng)率、體質(zhì)量增加率也顯著下降。SUN等[12]用發(fā)酵棉粕替代魚(yú)粉投喂凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，4周后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中游離棉酚含量超過(guò)116 mg/kg時(shí)，特定生長(zhǎng)率顯著降低。用棉粕100%替代豆粕投喂尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×O.aureus)幼魚(yú)，雖然游離棉酚含量只有46.74 mg/kg，但經(jīng)過(guò)8周投喂，尼羅羅非魚(yú)的特定生長(zhǎng)率顯著低于對(duì)照組[13]。在對(duì)鯉研究中也發(fā)現(xiàn)，以棉粕替代魚(yú)粉投喂幼魚(yú)，當(dāng)游離棉酚含量超過(guò)431 mg/kg時(shí)會(huì)顯著降低鯉的特定生長(zhǎng)率[14]。另有研究表明，長(zhǎng)期投喂棉粕飼料，會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，大量游離棉酚會(huì)蓄積在水產(chǎn)動(dòng)物的肝臟，嚴(yán)重影響其肝臟功能，使肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡化或萎縮現(xiàn)象，從而影響水產(chǎn)動(dòng)物的健康[14-15]。

目前關(guān)于游離棉酚對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物毒性的研究，主要集中在通過(guò)棉粕替代豆粕、魚(yú)粉或在基礎(chǔ)飼料中添加醋酸棉酚的方式來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、生理的影響方面。由于棉粕中除含有游離棉酚外，還有環(huán)丙烯類脂肪酸等其他抗?fàn)I養(yǎng)因子，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的直接毒性作用可能是各種抗?fàn)I養(yǎng)因子共同作用的結(jié)果[16]；此外，游離棉酚能夠與某些營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合，長(zhǎng)期投喂后，降低了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的利用率，從而影響水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)[9]。因此，本研究通過(guò)口灌鯉醋酸棉酚后，測(cè)定其血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟抗氧化酶活力，并觀察肝細(xì)胞凋亡情況，來(lái)評(píng)價(jià)醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟的毒性作用，以期為棉粕的合理利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物

黃河鯉購(gòu)自鄭州市中牟國(guó)家農(nóng)業(yè)園，選取平均體質(zhì)量為(60.0±2.5)g的健康鯉魚(yú)，暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，投喂商品飼料，每日投喂3次，投喂時(shí)間分別為9:00、13:00、18:00，連續(xù)充氧，14 d后開(kāi)始試驗(yàn)。鯉于正式試驗(yàn)前禁食24 h。

1.2 供試試劑

醋酸棉酚(純度>97.5%)購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

醋酸棉酚懸濁液的制備：準(zhǔn)確稱取0.12 g醋酸棉酚，溶于10 mL 0.65%生理鹽水，超聲波超聲10 min，使醋酸棉酚充分溶解，配制成12 mg/mL的醋酸棉酚懸濁液。

1.3 供試儀器

供試儀器主要包括高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5804R)、電子天平(Scout SE-SE602f)、酶標(biāo)儀(Thermo multiskan spectrum)、超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)、酶標(biāo)儀(Thermo)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler?96)等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)分組與取樣 醋酸棉酚處理組的鯉分別口灌0.1 mL的醋酸棉酚懸濁液(即按照鯉體質(zhì)量口灌醋酸棉酚劑量為20 mg/kg)，對(duì)照組的鯉口灌0.1 mL生理鹽水，分別于口灌后的0.5、1、2、4、6、12、24、48、72 h對(duì)鯉進(jìn)行尾靜脈取血，并解剖取肝臟，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取7尾魚(yú)。將采集到的血液于4 ℃靜置12 h后，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上層血清，于-80 ℃保存，用于GOT和GPT活力測(cè)定。一部分鯉肝臟組織立即保存于4%多聚甲醛，用于組織切片制作和TUNEL分析；另一部分肝臟組織經(jīng)液氮研磨后置于無(wú)RNA酶EP管中，于-80 ℃保存，用于SOD和GSH-Px活力測(cè)定和凋亡基因表達(dá)量的檢測(cè)。

1.4.2 鯉血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟抗氧化酶活力測(cè)定 血清轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定：將鯉血清從-80 ℃超低溫冰箱取出，解凍后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算血清轉(zhuǎn)氨酶GOT和GPT活力。

肝臟抗氧化酶活力測(cè)定：準(zhǔn)確稱0.05 g鯉肝臟組織于1.5 mL無(wú)菌EP管中，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9加入0.45 mL 0.65%生理鹽水，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算肝臟抗氧化酶SOD和GSH-Px活力。

1.4.3 鯉肝臟組織總RNA提取及cDNA合成 稱取0.05～0.10 g鯉肝臟組織并加入1 mL RNAiso Plus，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取肝臟總RNA。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的總RNA在260 nm和280 nm處的OD值，檢測(cè)提取的總RNA濃度和純度，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)提取的總RNA的完整性，然后進(jìn)行cDNA合成。

1.4.4 鯉肝臟組織凋亡相關(guān)基因檢測(cè) 用超微量分光光度計(jì)測(cè)定合成的cDNA在260 nm和280 nm處的OD值，檢測(cè)合成的cDNA濃度，參照SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒方法處理后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以18SribosomalRNA基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算caspase3、caspase6、caspase7基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增的特異性引物

1.4.5 鯉肝臟組織切片制作和TUNEL分析 參照《臨床病理學(xué)技術(shù)》[17]中的操作規(guī)范，對(duì)鯉肝臟組織樣品進(jìn)行石蠟包埋、切片后，一部分進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，并于顯微鏡下閱片觀察鯉肝組織的形態(tài)變化；另一部分依據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，觀察鯉肝細(xì)胞凋亡情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0進(jìn)行Duncan’s單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸棉酚對(duì)鯉血清GOT、GPT活力的影響

對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后，其血清中GOT活力在口灌醋酸棉酚后0.5 h時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，口灌后48 h和72 h時(shí)鯉血清中GOT活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)鯉血清中GOT活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖1)。鯉血清中GPT活力在口灌醋酸棉酚后0.5 h和1 h時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，口灌醋酸棉酚后2 h和12 h時(shí)鯉血清中GPT活力高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)鯉血清中GPT活力均低于對(duì)照組，4 h和48 h時(shí)與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(圖2)。

*表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)，下同

圖2 醋酸棉酚對(duì)鯉血清GPT活力的影響Fig.2 Effect of gossypol acetate on GPT activity in serum of Cyprinus carpio

2.2 醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟SOD、GSH-Px活力的影響

對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后，其肝臟SOD活力在口灌后0.5、1、2、48 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在口灌后4 h和12 h時(shí)鯉肝臟SOD活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，口灌后6、24、72 h時(shí)鯉肝臟組織SOD活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3)。鯉肝臟的GSH-Px活力除口灌后4 h與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)以及6、12 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)外，其他時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4)。

2.3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響

如圖5所示，對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，其肝細(xì)胞邊界清晰，肝細(xì)胞大小無(wú)明顯變化，細(xì)胞核大小無(wú)明顯變化。如圖6B所示，箭頭所指的凋亡肝臟細(xì)胞被染為棕色。但對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后24 h時(shí)，其肝細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)被深染的細(xì)胞核，與TUNEL陰性對(duì)照、對(duì)照組現(xiàn)象一致(圖6A、6C和6D)。

2.4 醋酸棉酚對(duì)鯉caspase3、caspase6和caspase7基因表達(dá)的影響

如圖7所示，對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后24 h時(shí)，其肝臟caspase3、caspase6和caspase7基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟SOD活力的影響Fig.3 Effect of gossypol acetate on the activity of SOD in liver of Cyprinus carpio

圖4 醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟GSH-Px活力的影響Fig.4 Effect of gossypol acetate on the activity of GSH-Px in liver of Cyprinus carpio

A：對(duì)照組；B：醋酸棉酚組。HC：肝細(xì)胞；N：細(xì)胞核；Nu：核仁

A：TUNEL陰性對(duì)照；B：TUNEL陽(yáng)性對(duì)照；C：對(duì)照組；D：醋酸棉酚組。箭頭標(biāo)識(shí)的為3′-OH末端缺口，代表DNA斷裂，細(xì)胞凋亡

圖7 醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟凋亡基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of gossypol acetate on the expression of apoptosis gene in liver of Cyprinus carpio

3 結(jié)論與討論

3.1 醋酸棉酚對(duì)鯉血清GPT和GOT活力的影響

GPT和GOT是判定肝功能的重要指標(biāo)之一，其主要存在于肝臟細(xì)胞中。正常情況下，血液中GPT和GOT含量較低，當(dāng)肝臟細(xì)胞發(fā)生炎癥或者損傷時(shí)，會(huì)釋放大量的GPT和GOT進(jìn)入血液，使血液轉(zhuǎn)氨酶濃度升高[18-19]。

CAI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加56%棉粕(游離棉酚含量為473 mg/kg)或飼料中添加642 mg/kg的醋酸棉酚投喂異育銀鯽幼魚(yú)24周后，其血清GOT和GPT活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；蔣春琴等[11]研究表明，在飼料中添加300 mg/kg醋酸棉酚投喂異育銀鯽幼魚(yú)8周后，其血清GOT和GPT活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，但添加900 mg/kg醋酸棉酚時(shí)，異育銀鯽幼魚(yú)血清GOT和GPT活力顯著高于對(duì)照組。在草魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用棉粕全部替代魚(yú)粉(游離棉酚含量為82.3 mg/kg)的飼料投喂草魚(yú)幼魚(yú)6周后，其血清GPT活力顯著高于對(duì)照組[21]；在飼料中添加114 mg/kg的游離棉酚投喂草魚(yú)成魚(yú)8周后，其血清GOT和GPT活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異[9]。對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在飼料中添加160.9 mg/kg游離棉酚投喂4周后，凡納濱對(duì)蝦血清GOT和GPT活力與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異[12]。對(duì)鯉的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中棉粕含量超過(guò)36%(游離棉酚含量為431 mg/kg)，對(duì)鯉幼魚(yú)投喂8周后，其血清GPT和GOT的活力顯著高于對(duì)照組[14-15]。由此可見(jiàn)，游離棉酚對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肝臟毒性作用與動(dòng)物種類、個(gè)體大小、投喂劑量及投喂時(shí)間有很大關(guān)系。但上述研究主要是將棉粕作為蛋白質(zhì)原料或在飼料中直接添加游離棉酚來(lái)研究游離棉酚對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肝臟的毒性作用，結(jié)果容易受到棉粕中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子或飼料中其他成分影響。本研究通過(guò)單次口灌的方式來(lái)研究游離棉酚對(duì)鯉肝臟的毒性作用，避免了其他因素的影響，結(jié)果顯示，對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后，其血清中GOT活力在口灌醋酸棉酚后0.5 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，GPT活力在口灌醋酸棉酚后0.5 h和1 h時(shí)顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，游離棉酚在短時(shí)間內(nèi)對(duì)鯉的肝功能具有一定影響，但這種影響隨著時(shí)間推移逐漸減弱，并未造成鯉的肝臟病理性損傷。

3.2 醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟抗氧化酶活力的影響

本研究結(jié)果顯示，對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚后，其肝臟組織SOD活力在口灌后0.5、1、2、48 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組，GSH-Px活力在口灌后0.5、1、2、24、48、72 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組。表明在游離醋酸棉酚存在的條件下，水產(chǎn)動(dòng)物血清GPT和GOT活動(dòng)只在短時(shí)間內(nèi)顯著升高，與上述研究結(jié)果一致。這可能是由于SOD和GSH-Px在清除游離棉酚產(chǎn)生自由基的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而肝臟在24 h內(nèi)可完成自我修復(fù)、發(fā)揮正常功能。由此可見(jiàn)，不同劑量的游離棉酚對(duì)動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶活力影響不同。游離棉酚本身作為一種抗氧化劑，在低劑量時(shí)并不引起動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶活力的增加，而在高劑量時(shí)游離棉酚會(huì)產(chǎn)生大量自由基，促使抗氧化酶活力增加從而達(dá)到解毒作用，但當(dāng)其超過(guò)一定劑量范圍時(shí)，可能會(huì)破壞抗氧化酶系統(tǒng)，使動(dòng)物肝臟失去自我解毒功能，從而導(dǎo)致肝臟病變。

3.3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝細(xì)胞形態(tài)的影響

CAI等[20]研究表明，在飼料中添加642 mg/kg的游離棉酚，連續(xù)飼喂異育銀鯽24周后，其肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化；蔣春琴[26]研究卻發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加900 mg/kg的醋酸棉酚投喂異育銀鯽8周后，其肝細(xì)胞核體積增大，細(xì)胞間界限變模糊。侯紅利[15]研究表明，當(dāng)用含有30.98%棉粕的飼料投喂鯉8周后，鯉肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡化現(xiàn)象；而WANG等[14]研究表明，當(dāng)鯉飼料中游離棉酚添加量達(dá)54%時(shí)，連續(xù)投喂8周后，鯉肝細(xì)胞出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，對(duì)鯉單次口灌20 mg/kg醋酸棉酚后24 h時(shí)，鯉肝細(xì)胞排列整齊、界限清晰，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，并未引起肝臟組織病變。由此可見(jiàn)，鯉肝臟組織的病變是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，且與投喂醋酸棉酚的劑量和投喂時(shí)間有關(guān)。

3.4 醋酸棉酚對(duì)鯉肝細(xì)胞凋亡的影響

游離棉酚可抑制人肝癌等癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。研究表明，使用不同劑量的游離棉酚處理卵巢癌細(xì)胞24 h后，隨著游離棉酚劑量的升高，卵巢癌細(xì)胞的凋亡率最高增加了70%[27-28]；使用不同劑量的游離棉酚處理直腸癌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡比例最高為46%，同時(shí)上調(diào)了caspase3基因的表達(dá)[29]。細(xì)胞凋亡過(guò)程主要由caspase家族所介導(dǎo)，活化后的caspase激活了下游凋亡因子，最終引起DNA的降解。其中caspase3、caspase6和caspase7是執(zhí)行細(xì)胞凋亡階段的主要效應(yīng)分子，可直接導(dǎo)致細(xì)胞核裂解，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，對(duì)鯉單次口灌醋酸棉酚24 h時(shí)，未導(dǎo)致鯉肝細(xì)胞的DNA損傷和凋亡，并且caspase3、caspase6、caspase7基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低，這可能是由于游離棉酚進(jìn)入鯉體內(nèi)后，經(jīng)過(guò)鯉自身的代謝和排泄作用，緩解了肝臟的毒性作用，從而未引起肝細(xì)胞凋亡；但在相關(guān)體外試驗(yàn)中，受試細(xì)胞始終處于棉酚溶液中，缺少機(jī)體的代謝功能，從而誘發(fā)了細(xì)胞凋亡；也可能是由于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的增殖機(jī)制存在差異所致，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究表明，以20 mg/kg的劑量單次口灌鯉醋酸棉酚后，在短時(shí)間內(nèi)引起了鯉肝臟的生理性變化，后期鯉通過(guò)增強(qiáng)其肝臟抗氧化酶活力來(lái)增強(qiáng)對(duì)醋酸棉酚的解毒作用，最終并未引起鯉肝臟的病理性損傷以及肝細(xì)胞的凋亡。