郭志軍，趙云雷，陳偉，王紅梅，龔海燕，桑曉慧，崔艷麗，趙佩

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽455000）

我國棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束病害，實際生產(chǎn)中很難徹底根治，已成為我國棉花生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，給棉花生產(chǎn)造成了極大損失[1-2]。長期棉花生產(chǎn)實踐表明，選育并種植抗病品種是最有效的防治措施。然而，由于陸地棉栽培種抗源匱乏，而且傳統(tǒng)育種方法選擇效率低、周期長，抗病育種進(jìn)展較慢。通過連鎖分析定位與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)而用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，可有效加快抗病新品種培育進(jìn)程[3-5]。

目前，國內(nèi)外開展了大量的棉花抗黃萎病QTL（Quantitative trait loci）定位方面的研究，定位群體也逐漸由陸陸群體和初級群體向陸海群體和高級群體演變，并取得了很大的進(jìn)展，定位了大量的抗病QTL[6-10]。但直接應(yīng)用于抗病遺傳改良并應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的尚未見報道，因此需要進(jìn)一步發(fā)掘和鑒定抗黃萎病QTL，以加快分子標(biāo)記輔助選擇抗病育種進(jìn)程。本研究通過構(gòu)建以陸地棉栽培種魯棉研28為遺傳背景的陸海高代回交群體，定位與黃萎病抗性相關(guān)的QTL，以期為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用高抗黃萎病海島棉品種“海7124”和高感黃萎病陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系 “TM-1”配制抗感組合F1，再以陸地棉主栽品種魯棉研28為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交、自交，最終分別得到137個BC4F1和BC4F2:3株系。

1.2 試驗設(shè)計

2013年分別在河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所病圃（以下簡稱“病圃”）和試驗農(nóng)場東場（以下簡稱“大田”），對 137 個 BC4F2：3株系進(jìn)行抗病性鑒定。病圃環(huán)境下，設(shè)3次重復(fù)，單行區(qū)，行長8 m，株距0.25 m，0.8 m等行距，隨機(jī)區(qū)組排列。病圃是人工感染的水泥池，長為20 m，寬為2.5 m，所接病原菌為具中等致病力的安陽菌系。每個病池均設(shè)抗病對照和感病對照，分別以中植棉2號和冀棉11為抗病和感病對照。大田環(huán)境下，設(shè)3次重復(fù)，兩行區(qū)，6 m行長，株距0.25 m，0.8 m等行距，隨機(jī)區(qū)組排列，其他管理同大田。

大田環(huán)境下于9月12號、9月25號，病圃環(huán)境下于8月5號、8月28號，按照全國統(tǒng)一病情分級標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22101.5―2009《葉棉花抗病蟲性評價技術(shù)規(guī)范第5部分：黃萎病》[11]（詳見表1）進(jìn)行病害調(diào)查，計算病情指數(shù)和相對（矯正）病情指數(shù)，并采用Excel 2010統(tǒng)計分析抗病鑒定結(jié)果，并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗。

病情指數(shù)＝（∑級數(shù)×每級的病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×4）×100；

相對病情指數(shù)＝實測病指×K.

其中K值是校正系數(shù)，用全國統(tǒng)一規(guī)定的感病對照病情指數(shù)50.0，除以本期鑒定感病對照病指實測值。

表1 棉花黃萎?、跫墑澐謽?biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading stand for cotton Verticillium wilt with five levels

1.3 分子檢測

采用改良的CTAB法提取海7124、TM-1和魯棉研28以及BC4F1群體的DNA[12]。利用2 010對SSR引物進(jìn)行多態(tài)性檢測，再利用多態(tài)性引物對BC4F1群體進(jìn)行擴(kuò)增檢驗。PCR（Polymerase chain reaction）擴(kuò)增體系、反應(yīng)程序和聚丙烯酰胺凝膠電泳參照張軍等[13]的方法。

1.4 遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位

參考Yu Jing等[14]構(gòu)建的整合遺傳連鎖圖譜，將在親本間和群體上均表現(xiàn)出多態(tài)性的Sim-ple sequence repeats（SSR）標(biāo)記直接錨定在染色體上，用Mapchart2.2生成遺傳連鎖圖。

采用WinQTLCart V2.5[15]軟件以復(fù)合區(qū)間作圖法檢測QTL，設(shè)置步長為1 cM（centi Morgan)，用似然比值即LR值進(jìn)行顯著性檢驗，當(dāng)LOD≥2.5時，則認(rèn)為存在QTL。QTL命名參照本課題已有的命名方法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR引物篩選以及在BC4F1群體中擴(kuò)增效果

采用2010對SSR引物進(jìn)行親本間多態(tài)性篩選，挑選擴(kuò)增條帶清晰而且在海7124和TM-1、魯棉研28之間具有多態(tài)性的引物，最終共篩選出494對多態(tài)性SSR引物，多態(tài)性比率約為24.6%。繼而，采用494對多態(tài)性SSR引物對BC4F1群體進(jìn)行擴(kuò)增檢驗，494對多態(tài)性引物中僅有243對引物具有群體多態(tài)性，占多態(tài)性引物的比率約為50%。

2.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

將243對具有群體多態(tài)性的SSR引物與Yu Jing等[14]構(gòu)建的整合遺傳連鎖圖譜進(jìn)行比對，直接將標(biāo)記定位到相應(yīng)的染色體上，并采用Mapchart2.2軟件繪制遺傳連鎖圖（圖1）。最終共將216個多態(tài)性SSR標(biāo)記錨定在26條染色體上，另有27個標(biāo)記未能進(jìn)入連鎖群。每條染色體上多態(tài)性標(biāo)記分布2～25個不等，其中Chr3、Chr10、Chr12、Chr13等四條染色體上標(biāo)記最少只有2個，第16條染色體上標(biāo)記最多為25個。采用進(jìn)入連鎖群的216個多態(tài)性位點繪制連鎖圖，圖譜可覆蓋棉花基因組全長3 880 cM，標(biāo)記間平均距離15.77 cM。

圖1 整合遺傳連鎖圖譜和定位的QTL在圖譜上的圖示Fig.1 The integrated genetic linkage map and QTL mapped in the linkage map

圖1（續(xù)）Fig.1 (Continued)

圖1（續(xù)）Fig.1 (Continued)

2.3 不同試驗條件下病情指數(shù)變異

棉花黃萎病抗性屬數(shù)量性狀，由微效多基因控制，易受環(huán)境影響。數(shù)量性狀表現(xiàn)型是基因型與環(huán)境互作的結(jié)果，應(yīng)服從正態(tài)分布。因此，在進(jìn)行QTL定位前，首先要對群體表型進(jìn)行正態(tài)分布檢驗。對大田和病圃不同調(diào)查時期的BC4F2:3家系病情指數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布統(tǒng)計，結(jié)果表明大田和病圃兩個環(huán)境下，只有病圃環(huán)境下8月28日調(diào)查時期下BC4F2家系的峰度略大于1，其余時期的BC4F2家系病指斜度和峰度絕對值均小于1，服從正態(tài)分布，調(diào)查結(jié)果可用于QTL定位（表 2）。

表2 BC4F2家系病指基本統(tǒng)計分析Table 2 The descriptive analysis of the disease index to Verticillium wilt by the BC4F2families

2.4 QTL定位分析

采用WinQTLCart V2.5軟件以復(fù)合區(qū)間作圖法定位QTL，共定位到6個與黃萎病抗性相關(guān)的 QTL（表 3）。

大田環(huán)境下，在9月12日這一時期檢測到2個 QTLs即 qnV14-2和 qnV14-3，2個 sQTL均位于第14條染色體上，均與分子標(biāo)記NAU3312相連鎖，貢獻(xiàn)率分別為19.98%和14.84%；大田9月25日調(diào)查時期未檢測到QTL。

病圃環(huán)境下，共定位到4個QTLs。其中在8月5日這一時期定位到2個QTLs即qdV1-1和qdV15-1，分別位于Chr1和Chr15染色體上，分別與分子標(biāo)記NAU5107和NAU3346相連鎖，貢獻(xiàn)率分別為14.15%和20.26%；病圃8月28日調(diào)查時期未檢測到QTL。

采用相對病情指數(shù)，也定位到2個QTLs即qdV5-1和qdV14-1，分別位于Chr5和Chr14染色體上，分別與分子標(biāo)記JEPPR0050和NAU3913相連鎖，貢獻(xiàn)率分別為8.56%和11.11%。

表3 復(fù)合區(qū)間作圖法定位抗黃萎病QTLTable 3 Mapping QTL for Verticillium wilt resistance by composite interval mapping method

3 討論

3.1 關(guān)于作圖群體的選擇

作圖群體不僅是構(gòu)建遺傳連鎖圖的根本，也是QTL定位的基礎(chǔ)，其中構(gòu)建群體時所選擇的親本及群體的類型是決定群體優(yōu)劣的重要因素。本研究首先選用高抗黃萎病的海島棉品種海7124和高感黃萎病的陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1做抗、感親本，配制雜交組合F1，以確保分離后代的黃萎病抗性表現(xiàn)型具有明顯的差異。同時，為了創(chuàng)制能夠更好的應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的抗病新品系，自F1之后將輪回親本更換為生產(chǎn)上綜合性狀優(yōu)良、大面積推廣的陸地棉栽培種魯棉研28。經(jīng)4輪回交，BC4F1群體遺傳背景大都趨近于魯棉研28，可有效地削弱QTL與遺傳背景的互作效應(yīng)，可提高定位的精度。但是連續(xù)回交，也造成作圖時標(biāo)記偏分離現(xiàn)象嚴(yán)重，前人研究中同樣出現(xiàn)[17-19]。偏分離位點的存在勢必會對作圖的精度造成一定的影響，然而若僅僅是簡單的刪除這些偏分離位點，將會導(dǎo)致遺傳連鎖群覆蓋率偏低，也會遺漏很多重要的信息。因此采用較高的LOD值或采用比較作圖或抽樣群體作圖是處理偏分離標(biāo)記的比較好的方法[20]。本研究在采用較高LOD值時能夠進(jìn)入連鎖群的標(biāo)記較少，且大多數(shù)標(biāo)記被定位在同一連鎖群上，究其原因，主要在于經(jīng)連續(xù)回交，BC4F1群體所攜帶的海島棉片段很少，因此參考Yu Jing等[14]的高密度遺傳連鎖圖來定位QTL。

近年來，陸海漸滲系逐漸被應(yīng)用到棉花相關(guān)性狀的QTL定位。戎福喜等[21]采用陸海漸滲系定位了與棉花吐絮期葉綠素含量、熒光參數(shù)及相關(guān)性狀的QTL，共計44個。趙君等[10]采用染色體片段代換系定位了一個抗病主效QTL，位于D4染色體，可解釋表型變異64.8%。本研究中，對BC4F1群體進(jìn)行擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)，BC4F1群體中只滲透有少數(shù)的海島棉染色體片段，最少的為1個，最多的為38個，雜合居多，純合的海島棉染色體片段僅有12個，而且其中7個片段聚合在同一份材料中。因此，本群體可為今后開展以陸海漸滲群體或CSSL群體抗病QTL精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。

3.2 QTL定位

棉花黃萎病是一種土傳真菌維管束病害，其發(fā)生和發(fā)展受環(huán)境影響很大，因此，抗病性鑒定準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為提高試驗精準(zhǔn)度，本研究設(shè)置大田和病圃兩個環(huán)境進(jìn)行抗病性鑒定。

采用復(fù)合區(qū)間作圖法在兩個環(huán)境下共檢測到6個QTLs，其中大田環(huán)境下2個，病圃環(huán)境下4個。大田環(huán)境下檢測到的QTLs相對較少，可能與2013年氣溫偏高有關(guān)，氣溫偏高在一定程度上會抑制黃萎病害的發(fā)生和發(fā)展，對鑒定結(jié)果有一定的影響。定位到的6個QTLs中除qdV5-1以外，其余5個QTLs貢獻(xiàn)率均大于10%。其中，QTL qdV15-1位于第15條染色體上，張保才[22]定位 到 的 QTLs DImean-1-BC2F1、DIf-1-BC1S1 和DI825-1-BC2F1以及王沛政[23]定位到的QTL qVW-Chr.15-1同樣位于第15條染色體上。病圃環(huán)境下定位到的QTL qdV5-1與張保才[22]定位的DImean-3-BC2F1、DIf-5-BC2F1以 及 楊 昶[24]定 位 的qVV-A5-1RIL592、qVL-A5-1RIL592 和 qVL-A5-1RILBP2和寧志怨[25]定位的qVW-A5-1均位于第5條染色體上。本研究中在大田和病圃兩個環(huán)境下，在第14條染色體上共檢測到3個QTLs分別為 qnV14-2、qnV14-3、 qdV14-1，張保才[24]在第14條染色上檢測到 2個 QTLs DIf-4-BC2F1、DIf-3-BC2F1，同時寧志怨[25]也在第 14條染色體（D2）上檢測到 QTL qVWD2-1。同時，本研究在病圃條件下，在第1條染色體上新檢測到1個QTL qdV1-1。

由于不同的QTL定位研究所采用的材料、標(biāo)記均有所不同，因此，不同研究之間所共有的標(biāo)記較少，很難將已定位的QTL與前人相比較。通過與前人相比較，也只能明確本研究所定位到的QTL與前人的在染色體水平上相同。然而，隨著生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的發(fā)展及其在玉米相關(guān)性狀基因比較定位上的成功應(yīng)用[26-27]，為通過參考高密度遺傳連鎖圖譜進(jìn)行QTL定位和整合提供參考。本研究進(jìn)行QTL定位時，參考Yu Jing等[14]整合的遺傳連鎖圖，經(jīng)與Guo等[28]的高密度遺傳連鎖圖譜相比對，雖然標(biāo)記之間的距離有所不同，但在染色體上的位置和順序基本一致。因此，本研究所定位的QTL應(yīng)該是準(zhǔn)確可靠的，與之相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記可以嘗試應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

4 結(jié)論

本研究定位到了6個抗黃萎病QTLs，分別位于6條染色體上，第14條染色體上最多為4個。與6個QTLs相連鎖的分子標(biāo)記NAU3312、NAU5107、NAU3346、JESPR0050、NAU3913 可嘗試應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇抗病育種。