楊秀，許艷超，楊芳芳，蔡小彥，侯宇清，王玉紅，王星星，王坤波，劉方，周忠麗

（棉花生物學國家重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽455000）

陸地棉（Gossypium hirsutumL.）是世界上重要的經(jīng)濟作物，為紡織品生產(chǎn)提供天然的纖維[1]。隨著作物生產(chǎn)的發(fā)展和環(huán)境的變化，棉花生產(chǎn)正在面對土壤鹽堿化、干旱和極端溫度等非生物脅迫。

其中，鹽堿化是全球農(nóng)業(yè)面臨的主要環(huán)境問題之一[2]。植物生長對鹽脅迫的反應主要分為2個階段，第1個階段是快速的滲透階段，能夠抑制幼葉的生長，第2個是緩慢的離子毒害階段，加速成熟葉片的衰老[3-4]。許多學者關(guān)注植物鹽脅迫應答機制，提高了對植物鹽脅迫響應調(diào)節(jié)機制的認識[5-7]。

鈣離子（Ca2＋）在植物信號轉(zhuǎn)導中的重要調(diào)節(jié)作用已被充分證實。在鈣離子信號轉(zhuǎn)導過程中，鈣離子傳感器發(fā)揮重要的作用，調(diào)節(jié)各種效應蛋白的活性，以協(xié)調(diào)適當?shù)募毎磻猍8]。植物鈣離子傳感器主要有3類：鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）和類鈣調(diào)素（Calmodulin-like，CML）蛋白、鈣調(diào)磷酸酶 B-like（Calcineurin B-like，CBL）蛋白與鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CDPK）[9-11]。CML 是 1 類鈣結(jié)合蛋白，每個蛋白具有至少1個EF-hand保守結(jié)構(gòu)域（為螺旋 -環(huán) -螺旋結(jié)構(gòu)， 只能結(jié)合 1個 Ca2＋）[12-13]。CML是植物中普遍存在的鈣離子結(jié)合蛋白[11,14]。例如，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[15]、水稻（O-ryza sativa）[16]、番茄（Solanum lycopersicum）[17]和大豆（Glycine max）[18]基因組中分別鑒定到50個、32個、52個、68個CML基因，它們廣泛參與生物脅迫和非生物脅迫等生物學過程。擬南芥CML24是1種在多種器官中表達并響應多種刺激的基因，它編碼1種潛在的Ca2＋傳感器，該傳感器可能響應脫落酸（Abscisic acid，ABA）、日照時間和各種鹽分[15]。 此外，CML37、CML42、CML38和CML39對很多環(huán)境脅迫也有響應，如干旱、鹽與脫落酸（Abscisic acid，ABA），其中CML37 和CML42與干旱脅迫反應有關(guān)，但具有拮抗作用[19-20]。非生物脅迫和ABA也能快速誘導ATCML9在幼苗中的表達，并通過影響ABA介導的途徑增強對鹽和干旱脅迫的耐受性[21-22]。水稻CML基因OsMSR2也是通過ABA介導的途徑應對干旱和鹽脅迫[23]。

盡管前人對擬南芥和水稻、大豆中的CML基因進行了全基因組鑒定，但關(guān)于棉花中CML基因的鑒定和功能研究有限。本研究通過生物信息學方法，分別獲取陸地棉（Gossypium hirsutumL.）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondiiUlbrich）、亞洲棉（Gossypium arboreumL.）CML基因家族成員，對其系統(tǒng)進化關(guān)系、編碼產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域、染色體定位、順式作用元件以及在鹽脅迫下的表達模式等進行分析，并通過病毒誘導基因沉默技術(shù)（Virus-induced gene silencing，VIGS）初步驗證其功能，為棉花CML基因功能的后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 棉花CML家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析

利用擬南芥和水稻CML家族蛋白序列，在CottonGen 數(shù)據(jù)庫（https://www.cottongen.org/）中比對棉花（陸地棉、雷蒙德氏棉、亞洲棉）CML蛋白序列，人工去除冗余蛋白序列。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和 PFAM（http://pfam.sanger.ac.uk/）預測并分析上述候選蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，剔除不含完整保守結(jié)構(gòu)域的序列。同時，利用 COTTON FGD（http://www.cottonfgd.org/）數(shù)據(jù)庫對棉花CML基因的染色體位置及其編碼產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量和理論等電點等基本信息進行分析。

1.2 棉花CML基因家族系統(tǒng)進化分析

利用Clustal X 2.0程序?qū)Λ@得的擬南芥、水稻、陸地棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉的CML蛋白序列進行多序列比對，利用MEGA 6.0軟件，生成.meg格式文件，然后采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其Bootstrap method值設為1 000，其余參數(shù)設為默認值。

1.3 陸地棉CML蛋白基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

CML蛋白序列的保守基序分析采用MEME在線軟件預測，參數(shù)設置如下：“Maximum number of motifs” 為 15；“Occurrences of a single motif” 為 “zero or one per sequence”。 采 用 CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/） 數(shù) 據(jù) 庫 查 找CML的保守結(jié)構(gòu)域信息，利用TBtool作圖工具繪制保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 陸地棉CML家族基因的順式作用元件分析

利用棉花基因組數(shù)據(jù)庫Cotton FGD（http://www.cottonfgd.org/）提取陸地棉CML基因序列轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游1 500 bp序列，然后將獲得的序列提交到Plant CARE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）數(shù)據(jù)庫中，鑒定啟動子區(qū)域可能存在的順式作用元件。

1.5 陸地棉CML家族基因的染色體定位

應用所獲得的信息，利用MapChart 2.2[24]本地軟件繪制棉花CML家族基因在染色體上的位置圖。

1.6 陸地棉CML家族基因表達模式分析

利用本實驗室陸地棉鹽脅迫（300 mmol·L－1NaCl）下根和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將CML家族基因的表達量經(jīng)過標準化處理，用FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值表示，并以log2形式轉(zhuǎn)化，采用MeV4軟件繪制熱圖，進行層次聚類分析。

1.7 RNA的提取與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

利用天根RNA試劑盒提取總RNA，并用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第1鏈cDNA。使用NCBI primer-BLAST設計qRT-PCR引物（表1）。試驗采用SYBR染料法，基于ABI 7500 fast平臺。體系為 20 μL，包含 10 μL SYBR Green PCR mix， 上下游引物各 0.5 μL，2 μL 的稀釋 cDNA模板及7 μL ddH2O。qRT-PCR反應程序為：95℃10 min；循環(huán)階段：95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線階段：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。以Actin作為內(nèi)參基因，采用2－△△CT方法計算基因的相對表達量，每個基因的表達反應重復3次。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1qRT-PCR primer sequence

1.8 陸地棉CML44-2在棉花中的功能驗證

選用瑪利加朗特棉85作為試驗材料（由本實驗室保存）。菌種：農(nóng)桿菌菌株LBA4404為本實驗室保存；VIGS病毒載體TRV2及包含TRV1和TRV2::CLA1載體的農(nóng)桿菌菌株。為了構(gòu)建GhCML44-2基 因 的 VIGS載 體（TRV2::GhCML44-2），用引物GhCML44-2-F（5'-GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCGACTTGCGACGGATTTTCG-3'）和GhCML44-2-R（5'-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCGCCTCAATCTTGGTGCTG-TG-3'）從瑪利加朗特棉85中擴增GhCML44-2基因。利用濾紙發(fā)芽法處理棉花種子，3～4 d后，移入培養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，溫度為25℃，每隔5 d換1次培養(yǎng)液，待2片子葉展開且真葉尚未發(fā)育時即可用于VIGS操作。在VIGS農(nóng)桿菌接種后14 d，將沉默苗進行鹽脅迫處理（300 mmol·L－1NaCl），并以注射空載體菌株和未注射菌株的棉苗為對照。于鹽脅迫處理后48 h，采集葉片樣品進行基因相對表達量、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、脯氨酸（Proline，Pro）含量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性測定，詳細步驟按照北京索萊寶生物公司超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量和丙二醛含量檢測試劑盒（可見分光光度法）說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花CML家族成員的鑒定與理化性質(zhì)

利用從TAIR數(shù)據(jù)庫和水稻基因組數(shù)據(jù)庫中分別下載的50個擬南芥和32個水稻CML蛋白序列作為棉花CML蛋白的查詢序列，進行BLASTP和HMMER搜索獲得的候選氨基酸序列用Pfam、SMART、CDD工具預測保守結(jié)構(gòu)域，并剔除不含EF-hand結(jié)構(gòu)域的冗余序列。在陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉中分別獲得了154個、78個、74個CML基因。3個棉種CML家族成員基因組序列差異較大（200～5 000 bp）；除了個別的CML蛋白外，其他的蛋白序列氨基酸殘基數(shù)差異較小，一般為200個左右；CML基因編碼產(chǎn)物的理論等電點（pI）、相對分子質(zhì)量大小差異不大，表明棉花CML蛋白的理化性質(zhì)差異不大。大多數(shù)CML蛋白的等電點小于7，表明CML蛋白中的氨基酸大部分為中性或酸性。

2.2 棉花CML家族基因進化分析

為了揭示棉花CML基因家族的進化關(guān)系，以擬南芥和水稻CML家族基因作為參考，構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖1、圖2）。根據(jù)親緣關(guān)系將CML基因家族分為 A～H 8個亞族，A、B、E、F、H亞族都同時包含雙子葉植物棉花、擬南芥和單子葉植物水稻中至少1個CML基因，而C、D、G亞族僅包含雙子葉植物棉花和擬南芥的CML基因，這說明C、D、G亞族CML基因的出現(xiàn)時間晚于單、雙子葉的分化時間。從物種CML基因數(shù)量上比較，陸地棉CML基因的數(shù)量遠遠高于擬南芥和水稻，表明在擬南芥和棉屬分化后，CML基因在棉屬中發(fā)生了倍增，說明CML基因可能在棉屬適應外界環(huán)境的進化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。亞洲棉和雷蒙德氏棉CML基因數(shù)量相差不大，幾乎呈現(xiàn)一一對應關(guān)系，而在陸地棉中CML基因成員大幅擴增，這符合物種進化關(guān)系。

圖1 擬南芥、水稻、陸地棉CML家族基因的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of CML family genes in Arabidopsis thaliana , Oryza sativa L.and Gossypium hirsutum L.

圖2 亞洲棉、陸地棉、雷蒙德氏棉CML家族基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic trees of CML family genes of Gossypium hirsutum L., G.raimondii Ulbrich and G.arboreum L.

2.3 陸地棉CML家族蛋白保守結(jié)構(gòu)分析

CML蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域已在擬南芥、水稻等多個模式植物中被鑒定分析。擬南芥中的50個和水稻的32個CML家族成員都具有保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域。本研究通過CDD數(shù)據(jù)庫對154個陸地棉CML家族蛋白進行保守結(jié)構(gòu)查詢，結(jié)果如圖3所示，該家族所有蛋白都具有高度保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域，且除該結(jié)構(gòu)域外，沒有其他已知功能的結(jié)構(gòu)域。

2.4 陸地棉CML家族基因染色體定位分析

根據(jù)棉花基因組信息，對154個陸地棉CML基因進行了染色體定位分析（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有130個CML基因定位于26條染色體上，24個不能明顯定位于任何染色體，而是存在于scaffold上，且基因在染色體上的分布相對不均勻，一些染色體和染色體區(qū)域，有高密度的基因分布。D02染色體有最多的基因分布。有趣的是，許多基因成簇分布，特別是在 A7、A11、D06、D11染

色體的頂部和A12、D09、D12染色體的底部?；蛟谌旧w上的這種不平衡分布表明遺傳變異存在于進化過程中。

圖3 陸地棉CML家族蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of CML family protein sequences in upland cotton

2.5 順式作用元件分析

利用Plant CARE軟件對GhCML基因啟動子區(qū)上游1 500 bp的序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)的順式作用元件包括ABA反應元件（ABRES）、低溫應答元件（LTRS）、防御和應激反應元件（TC-rich repeats）、水楊酸應答元件（TCA-element）、MeJA-應 答 元 件（TGACG-motif）、MYB- 結(jié) 合 位 點（MBS）。 然而，ABRES、TCA-element和 TGACG-motif屬于植物激素反應元件。在GhCML基因啟動子中，ABRE是最豐富的順式作用激素應答元件，100個CML基因成員含有ABRE。GhCML基因上游區(qū)域的其他重要順式作用元件屬于環(huán)境脅迫相關(guān)元件。主要發(fā)現(xiàn)3種不同類型的對外部環(huán)境脅迫做出反應的順式作用元件，它們是低溫應答型（LTR）、應激應答型（TC-rich repeats）和干旱響應型（MBS）?？偣灿?9個CML基因成員含有 TC-rich repeats，41 個成員包含 MBS，41 個成員包含LTR。推測外源環(huán)境脅迫可通過其響應順式作用元件誘導GhCML基因的表達，進一步提高植物對環(huán)境脅迫的抗性。

2.6 陸地棉CML基因鹽脅迫表達聚類分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對鹽脅迫下154個GhCML基因的表達模式進行分析（圖5）。其中，只有107個基因在鹽脅迫下差異表達，且在葉和根中表達情況不同。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇14個差異表達的GhCML基因，利用qRT-PCR進行表達模式分析，結(jié)果見圖6。在鹽脅迫下，14個CML基因在根和葉中的表達量不同，葉中上調(diào)表達的基因數(shù)量明顯多于根中上調(diào)表達的基因數(shù)量；在鹽處理12 h 時，GhCML35-4、GhCML10-1、GhCML25-3、GhCML42-4GhCML44-3、GhCML25-5 等基因在葉中的表達量最高，而GhCML49、GhCML44-1、GhCML44-6在根中的表達量最高。GhCML44-2、GhCML44-7在葉中的表達量明顯高于根中，且在3 h時最高。在葉和根中，相同的基因具有不同的表達模式，例如GhCML44-2基因在葉中不同時間點均上調(diào)，而在根中明顯下調(diào)。GhCML19-5在根中48 h明顯上調(diào)表達，而在其他組織和時間點均下調(diào)表達。以上結(jié)果顯示，GhCML基因以不同的方式參與鹽脅迫應答，且具有組織特異性。

圖5 陸地棉CML家族基因在棉花組織中的表達分析Fig.5 Expression analysis of CML family genes in upland cotton

圖6 鹽處理（300 mmol·L－1NaCl）不同時間棉花根、葉中14個 GhCML 基因的表達情況Fig.6 Expression of 14 GhCML genes in cotton roots and leaves at different times after NaCl treatment(300 mmol·L－1)

2.7 陸地棉CML44-2基因在棉花中功能驗證

侵染棉花植株10 d后被侵染棉花幼苗逐漸白化，20 d后再次觀察，發(fā)現(xiàn)植株仍存在白化現(xiàn)象，證明指示基因在棉花幼苗中沉默成功，且效果穩(wěn)定（圖7A）。分別初步驗證正常植株、TRV2空載、GhCML44-2沉默后棉花植株的基因表達量，結(jié)果（圖7B）顯示，正常植株和TRV2空載植株基因表達量無明顯變化，而GhCML44-2沉默后植株的基因表達量顯著降低，證明植株沉默成功。

鹽脅迫處理48 h后，發(fā)現(xiàn)GhCML44-2基因沉默后的植株比對照植株萎蔫嚴重（圖7C），與注射空載菌株的植株相比，SOD酶活性降低，MDA含量大幅升高，而PRO含量降低（圖7D～F）。由此推測，GhCML44-2基因參與調(diào)控植物SOD酶活性和脯氨酸、丙二醛的合成。

3 討論與結(jié)論

CML是所有真核生物中最保守的主要鈣離子傳感器蛋白。這類蛋白質(zhì)通過調(diào)節(jié)各種靶點在細胞信號網(wǎng)絡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而響應植物脅迫應答反應[25]。CML家族在其他作物中的功能研究已經(jīng)很深入，但在棉花中的研究少有報道。

圖7 VIGS驗證 GhCML 44-2基因的功能Fig.7 VIGS validates the function of GhCML 44-2 gene

本研究從陸地棉、雷蒙德氏棉和亞洲棉中分別鑒定出154、74和78個CML基因，大幅多于擬南芥（50個基因）、水稻（32個基因）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，一些GhCML與擬南芥和水稻CML基因具有同源性（圖1）。這些研究結(jié)果表明在植物CML基因之間存在較近的進化關(guān)系。染色體分布分析顯示，大多數(shù)GhCML基因隨機分布在不同的染色體上，一些基因沒有定位在任何染色體上。

保守結(jié)構(gòu)域的分析在確定基因功能方面發(fā)揮了重要作用[26]。EF-hand是CML蛋白中唯一預測到的結(jié)構(gòu)域，表明該結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ艿闹匾院捅匾?，EF-hand對Ca2＋結(jié)合和運輸具有重要的作用[16,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)所有GhCML基因家族成員中均存在EF-hand結(jié)構(gòu)域（圖3），這一結(jié)果與之前在擬南芥和水稻中的報道一致[16,27]。

Ca2＋信號轉(zhuǎn)導植物中的一些非生物脅迫，多種刺激均可以誘導CML基因的表達[28-31]。擬南芥CML24在所有主要器官中都表達，在受到黑暗、高溫、寒冷、ABA等影響的植物中，轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[15]。本研究順式作用元件分析顯示，GhCML基因啟動子均含有響應不同刺激（干旱、鹽、低溫和激素等）的作用元件。通過轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下多數(shù)GhCML基因表達量都有顯著的變化，這一結(jié)果暗示GhCML基因在響應鹽脅迫的過程中發(fā)揮作用。此外，本研究表明通過VIGS沉默GhCML44-2基因后棉花植株耐鹽能力明顯下降。由此推測，GhCML44-2基因可提高棉花耐鹽能力。

在CML基因家族中，很多基因已經(jīng)被研究[32]，但還有一些基因未曾被關(guān)注，這些基因是否在響應逆境脅迫通路或者在棉花的生長發(fā)育過程中具有重要作用，還需要進一步研究。