王 寧，昌孝濤，袁美麗，陳 浩

（1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.洛陽(yáng)市林業(yè)工作站，河南 洛陽(yáng) 471000；3.洛陽(yáng)市隋唐城遺址植物園，河南 洛陽(yáng)471002）

化學(xué)除草劑的危害愈來(lái)愈受到人們重視，利用植物化感作用對(duì)田間雜草進(jìn)行生態(tài)防控被認(rèn)為是環(huán)境友好，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新技術(shù)，并已被列入當(dāng)代農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)研究的重要研究方向［1-2］。香豆素（C9H6O2）是香豆素類物質(zhì)中形式最簡(jiǎn)單的化合物。鄔彩霞等［3］采用色譜分離等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)黃花草木樨Melilotus officinalis中化感物質(zhì)含量最高的是香豆素。黃花草木樨對(duì)藜Chenopodium album［4］，稗草Echinochloa crusgalli［5］， 蘇丹草Sorghum sudanense［6］和多花黑麥草Lolium multiflorum［7］等多種雜草均存在較強(qiáng)的抑制作用。此外，覃逸明等［8］研究發(fā)現(xiàn)：在鳳丹Paeonia ostii根際土壤中存在的5種化感物質(zhì)中，香豆素抑制作用最強(qiáng)。CHON等［9］研究發(fā)現(xiàn)：與肉桂酸、香草酸等其他酚酸類化感物質(zhì)相比，香豆素對(duì)苜蓿Medicago sativa的化感抑制作用最強(qiáng)。RAZAVI等［10］研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)香豆素質(zhì)量濃度達(dá)100 mg·L-1時(shí)，可完全阻礙生菜Lactuca sativa種子萌發(fā)及其幼苗根、莖生長(zhǎng)。上述研究均表明：香豆素有作為新型除草劑的開(kāi)發(fā)利用潛力，而有關(guān)香豆素對(duì)入侵植物的化感作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii為禾本科Gramineae山羊草屬Aegilops植物，最早起源于西亞及東歐等地，現(xiàn)已成為世界惡性雜草［11］。1955年，節(jié)節(jié)麥在中國(guó)河南省新鄉(xiāng)地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，如今已廣泛入侵至渭河流域陜西、甘肅，黃河流域河北、河南、山東以及內(nèi)蒙古等地，并成為中國(guó)麥田中最難防除的惡性雜草之一［12-13］。據(jù)報(bào)道，僅2003年河北南部地區(qū)由于節(jié)節(jié)麥危害導(dǎo)致的小麥損失就達(dá)10%～25%［14］。因嚴(yán)重威脅糧食的生產(chǎn)與安全，早在2007年節(jié)節(jié)麥已被列入中國(guó)首次發(fā)布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》［15］。生產(chǎn)上僅有甲基二磺隆和異丙隆對(duì)節(jié)節(jié)麥具有一定防除效果，但由于不同小麥品種及節(jié)節(jié)麥種群對(duì)上述2種除草劑的敏感性存在差異［16-17］，導(dǎo)致它們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用受到一定限制。這也是節(jié)節(jié)麥入侵范圍愈來(lái)愈廣泛的重要原因之一。為此，本研究以入侵植物節(jié)節(jié)麥為試材，探討香豆素對(duì)其種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為節(jié)節(jié)麥的生物防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年5月，節(jié)節(jié)麥種子來(lái)源于河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田（35°18′N(xiāo)，113°52′E）。研究在河南科技大學(xué)開(kāi)元校區(qū)林學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。固體香豆素來(lái)源于上海試劑廠。

1.2 方法

香豆素溶液配置：準(zhǔn)確稱?。ㄈf(wàn)分之一天平）75 mg香豆素，蒸餾水定容至500 mL，充分溶解后得150 mg·L-1香豆素溶液，分別稀釋得到50，100 mg·L-1的溶液，置4℃冰箱保存。使用時(shí)提前取出，室內(nèi)放置3～5 h，避免低溫溶液對(duì)種子萌發(fā)造成影響。

種子萌發(fā)試驗(yàn)：采用培養(yǎng)皿沙培法［18］。選取籽粒飽滿、大小基本一致的節(jié)節(jié)麥種子，先用體積分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，之后蒸餾水反復(fù)沖洗，室內(nèi)自然晾干備用。將種子置于鋪有經(jīng)高溫消毒處理石英砂的培養(yǎng)皿（直徑12 cm）內(nèi)，加入10 mL（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定）處理液，50?！っ?1，利用透明保鮮膜覆蓋包裹培養(yǎng)皿（保證培養(yǎng)皿口保鮮膜平展）以減少試驗(yàn)過(guò)程中水分的散失，并稱量記錄每皿的質(zhì)量（試驗(yàn)期間根據(jù)石英砂顏色，加入適量處理液保持每皿質(zhì)量不變）。各處理5次重復(fù)，各重復(fù)3皿。以加等量蒸餾水的處理為對(duì)照（ck）。置于晝夜25℃/15℃，光暗各12 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察統(tǒng)計(jì)1次種子萌發(fā)情況（以胚根長(zhǎng)度大于等于種子長(zhǎng)度為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)），培養(yǎng)10 d后各處理隨機(jī)選取10株幼苗分別測(cè)量根長(zhǎng)及苗高。其中，發(fā)芽率RG=（10 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100%，發(fā)芽指數(shù)IG=∑（Gt/Dt）， 其中：Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)，Gt為逐日發(fā)芽種子數(shù)。 抑制率［4，19］RI=（T0-T1）/T0。 其中：T1為處理值，T0為對(duì)照值。RI＜0為促進(jìn)作用，RI＞0，為抑制作用，RI絕對(duì)值大小代表抑制的強(qiáng)弱。

幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)：首先對(duì)節(jié)節(jié)麥種子進(jìn)行催芽處理（水浸泡24 h，25℃培養(yǎng)箱內(nèi)），選出露白基本一致的種子播種于裝有適量石英砂的塑料杯（開(kāi)口直徑10 cm，高15 cm）內(nèi)，10?！け?1，隨后加入15 mL（經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定）不同質(zhì)量濃度的處理液，以加等量蒸餾水的為對(duì)照（ck），各處理5次重復(fù)，各重復(fù)3杯。置于晝夜25℃/15℃，光暗各12 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。并分別在處理的5，10和15 d采樣，取全株進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。電導(dǎo)法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率（REC）［20］；酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)超氧化物歧化酶活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛質(zhì)量摩爾濃度［21］。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，利用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

隨香豆素溶液質(zhì)量濃度的增加，節(jié)節(jié)麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均明顯下降（表1）。不同質(zhì)量濃度處理的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。150 mg·L-1處理中，發(fā)芽率僅有31.60%，較對(duì)照下降66.38%。此外，從抑制率可看出，發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)的抑制率均大于0，且呈質(zhì)量濃度效應(yīng)的變化。由此表明，香豆素溶液對(duì)節(jié)節(jié)麥種子萌發(fā)存在較強(qiáng)的抑制作用。

隨香豆素質(zhì)量濃度的增加，節(jié)節(jié)麥幼苗的苗高及根長(zhǎng)同樣呈明顯的減少趨勢(shì)。其中，100和150 mg·L-1的處理苗高均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。此外，不同質(zhì)量濃度處理的根長(zhǎng)均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。香豆素對(duì)苗高及根長(zhǎng)的抑制率均大于0，且也隨溶液質(zhì)量濃度的增加而增大。由此表明，香豆素溶液對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗的生長(zhǎng)也存在明顯抑制作用。

表1 香豆素溶液對(duì)節(jié)節(jié)麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 1 Coumarin solution influence of Aegilops tauschii growth indexes on seed germination and growth of seedlings

2.2 香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗生理指標(biāo)的影響

由圖1A可知：相同質(zhì)量濃度處理中，節(jié)節(jié)麥幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速上升的變化。其中，50 mg·L-1處理中，處理后第5天時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率略低于對(duì)照，之后則均高于對(duì)照，至第15天時(shí)較第5天時(shí)增加顯著（P＜0.05）。100和150 mg·L-1處理中，相對(duì)電導(dǎo)率均高于對(duì)照，至第10天時(shí)較第5天時(shí)增加均已達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

相同質(zhì)量濃度處理中，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升的變化（圖1B）。其中，50 mg·L-1處理中，至第15天時(shí)增加達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。100和150 mg·L-1處理中，至第10天時(shí)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度較第5天時(shí)增加已達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。同樣，相同時(shí)間下，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度與香豆素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖1 不同質(zhì)量濃度香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響Figure 1 Relative electric conductivity and MDA content of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

相同質(zhì)量濃度處理中，節(jié)節(jié)麥幼苗的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增加的變化（圖2A）。其中，不同質(zhì)量濃度香豆素溶液處理中，至處理后第10天時(shí)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較第5天時(shí)增加均已達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。150 mg·L-1處理中，至第15天時(shí)較第10天時(shí)增加未達(dá)到顯著水平。且相同時(shí)間下，脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與香豆素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

50和100 mg·L-1處理中，超氧化物歧化酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)增加的變化，而150 mg·L-1處理中，超過(guò)氧化物歧化酶活性呈先升后降的變化（圖2B）。其中，50及100 mg·L-1處理中，至處理后第10天時(shí)超氧化物歧化酶活性較第5天時(shí)增加已達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。150 mg·L-1處理中，至第10天時(shí)超氧化物歧化酶活性較第5天時(shí)增加顯著，至第15天時(shí)較第10天時(shí)略有下降，但差異不顯著。且相同時(shí)間下，超氧化物歧化酶活性與香豆素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖2 不同質(zhì)量濃度香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及超氧化物歧化酶活性的影響Figure 2 Proline content and SOD activity of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

3 討論

種子能否正常萌發(fā)決定了植物的繁衍及生存，對(duì)該物種的更新至關(guān)重要。而發(fā)芽率的增加及下降則會(huì)降低植物在群落中的競(jìng)爭(zhēng)力及多度［22］。幼苗階段在植物的生命周期中較為關(guān)鍵，影響著植物的形態(tài)建成，且是植物對(duì)外界環(huán)境較為敏感的時(shí)期［23］。本試驗(yàn)結(jié)果表明：香豆素溶液對(duì)節(jié)節(jié)麥種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制作用，且抑制作用隨香豆素溶液質(zhì)量濃度的增加而增大。在王婧怡等［6］對(duì)蘇丹草，姚丹丹等［7］對(duì)多花黑麥草的研究中均發(fā)現(xiàn)：香豆素溶液對(duì)上述2種植物種子萌發(fā)存在一定的化感抑制作用。香豆素溶液處理造成節(jié)節(jié)麥種子發(fā)芽率下降的原因可能有：一是香豆素可能影響了種子萌發(fā)所需關(guān)鍵性酶等物質(zhì)，造成萌發(fā)過(guò)程中萌發(fā)所需能量物質(zhì)的缺乏，從而導(dǎo)致種子活力的下降；二是香豆素可能改變了節(jié)節(jié)麥種皮透性，進(jìn)而影響種子的吸水作用，造成種子內(nèi)部物質(zhì)的外滲，而此類物質(zhì)造成了真菌病原體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致種子腐爛而無(wú)法萌發(fā)。本研究的種子萌發(fā)后期，也確有種子腐爛現(xiàn)象的發(fā)生。此外，香豆素溶液處理對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗的苗高及根長(zhǎng)生長(zhǎng)也存在質(zhì)量濃度效應(yīng)的化感抑制作用。其中，不同質(zhì)量濃度處理中根長(zhǎng)的抑制率均明顯大于苗高。由此也表明：香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗根長(zhǎng)生長(zhǎng)的化感抑制作用大于苗高，這可能與根系最先直接接觸并吸收到處理物質(zhì)有關(guān)，只有在根系被抑制達(dá)到一定程度后，幼苗的地上部分才會(huì)逐漸受到影響。這與宋亮等［24］利用酚酸類物質(zhì)對(duì)苜蓿Medicago sativa的研究結(jié)論相符。

相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛是植物質(zhì)膜受傷害程度的重要反映指標(biāo)。本研究中，相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛質(zhì)量摩爾濃度均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加的變化。其中，相對(duì)電導(dǎo)率的增加表明香豆素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼苗膜結(jié)構(gòu)造成一定破壞，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲的增大；而丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的增加則表明膜脂過(guò)氧化作用的逐漸增大。此外，50 mg·L-1溶液處理中，至第10天時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛質(zhì)量摩爾濃度較第5天時(shí)增加均不顯著。這可能是香豆素質(zhì)量濃度低且處理時(shí)間短，節(jié)節(jié)麥通過(guò)自身的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)香豆素造成膜系統(tǒng)損傷進(jìn)行了積極修復(fù)的結(jié)果。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加是植物對(duì)逆境脅迫的重要生理反映，而游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。本研究中，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溶液處理中的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著增加，這是節(jié)節(jié)麥通過(guò)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加以適應(yīng)香豆素脅迫的結(jié)果，這也與香豆素處理蘇丹草［6］、多花黑麥草［7］可溶性糖含量增加的結(jié)論相符。而150 mg·L-1處理中，至第15天時(shí)較第10天時(shí)增加不顯著，這可能與香豆素溶液的過(guò)度脅迫所致。超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，其活性大小是植物抗逆性強(qiáng)弱的重要體現(xiàn)。本研究中，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶活性呈持續(xù)增加的變化，表明節(jié)節(jié)麥啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)香豆素處理造成的其體內(nèi)活性氧自由基的逐漸增加，這也是節(jié)節(jié)麥為適應(yīng)香豆素脅迫而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。150 mg·L-1處理中，至第15天時(shí)較第5天時(shí)增加顯著，但較第10天時(shí)略有下降。這表明隨著香豆素脅迫的進(jìn)一步加劇，幼苗體內(nèi)活性氧自由基的增加速率逐漸超過(guò)了超氧化物歧化酶的清除能力，造成自由基不斷積累，最終導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性的下降，這也與SCANDALIOS［25］及YE等［26］研究結(jié)論一致。