(貴陽市南明區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550002)

消化系統(tǒng)疾病是犬的多發(fā)病，其中犬結(jié)腸炎多因細(xì)菌感染、化學(xué)刺激、應(yīng)激反應(yīng)、結(jié)腸黏膜機(jī)械性損傷、過食、食物過敏或不耐受等原因造成[1，2]。潰瘍性結(jié)腸炎(UC)以結(jié)腸的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c(diǎn)，出現(xiàn)腹瀉、便血、黏液增多和腹痛等癥狀，并且緩解與發(fā)作相互交替[3]。PK結(jié)腸溶膠囊是大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院新開發(fā)的1種藥品，主要特點(diǎn)為膠囊在結(jié)腸內(nèi)溶解，直接作用于患處。本試驗(yàn)制作犬的急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，綜合評(píng)價(jià)口服PK結(jié)腸溶膠囊的療效，為犬結(jié)腸炎的治療探索更安全有效的治療藥物及療效判斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物：健康中華田園犬成年犬16只，體重10～15 kg，雌雄各半。

1.1.2飼養(yǎng)管理：試驗(yàn)犬在同一棟標(biāo)準(zhǔn)化圈舍內(nèi)單籠飼養(yǎng)，逐頭稱重并佩戴耳標(biāo)建立檔案，飼喂相同分量的日糧及水，預(yù)飼2周后注射犬英特威寵必威@優(yōu)免康四聯(lián)苗(犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒病、副流感，批號(hào)：A507A01)，再次確定健康后進(jìn)入正式試驗(yàn)。

1.1.3藥品試劑與實(shí)驗(yàn)儀器：(1)藥品試劑：PK結(jié)腸溶膠囊(大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院惠贈(zèng))、淀粉結(jié)腸溶膠囊、柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊、淀粉、乙酸、生理鹽水、復(fù)方新潔爾滅消毒液、犬眠寶、75%醫(yī)用酒精、碘酒、EDTA、10%MgSO4。(2)儀器用品：全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(Exigo，瑞典，SN-61564)、9215電子內(nèi)窺鏡、愛德士生化分析儀(IDEXX Vet Test，美國，OK51015)、C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x(USHIO INC Point-reader V，日本，AMD02A)、生物顯微鏡、常規(guī)手術(shù)器械及用品、燒杯、量杯、彈簧度盤秤、載玻片、蓋玻片。

1.2 方法

1.2.1分組：試驗(yàn)犬隨機(jī)分為4組(每組4只，雌雄各半)，即陰性藥物組(淀粉結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)、正常劑量組(PK結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)、 2倍劑量組(PK結(jié)腸溶膠囊2顆/kg)、陽性藥物組(柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)。

1.2.2制備動(dòng)物模型：在造模前 1 d，使用10%MgSO4溶液按照 5 mL/kg體重對(duì)所有試驗(yàn)犬灌腸后，禁食不禁水24 h。造模當(dāng)日，使用犬眠寶按照 0.15 mL/kg體重對(duì)所有實(shí)驗(yàn)犬肌肉注射進(jìn)行全身麻醉后，參照乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠實(shí)驗(yàn)制備動(dòng)物模型方法[4]，用聚乙烯導(dǎo)管自肛門伸入犬結(jié)腸 20 cm，緩慢注入7%乙酸溶液灌腸，保持犬頭低尾高的姿態(tài) 15 s，用生理鹽水 50 mL沖洗使乙酸溶液排出。

1.2.3分組給藥：造模后第 1 d，將空腹試驗(yàn)犬頭部抬高并打開口腔，對(duì)準(zhǔn)舌根部喂服各試驗(yàn)藥物。陰性藥物組喂服淀粉結(jié)腸溶膠囊 1 顆/kg，正常劑量組喂服PK結(jié)腸溶膠囊 1顆/kg，2 倍劑量組喂服PK結(jié)腸溶膠囊 2 顆/kg，陽性藥物組喂服柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊 1 顆/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定

1.3.1血樣采集：采血前向集血容器中加入適量EDTA抗凝劑，采集頸靜脈血2 mL，冰箱4 ℃保存，送檢過程避免血樣劇烈震蕩。

1.3.2白細(xì)胞總數(shù)檢測(cè)：使用Exigo全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組給藥后第 1 d、第 4 d、第 7 d 血樣的白細(xì)胞總數(shù)(WBC)。

1.3.3C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)：用USHIO INC Point-reader V(C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x)檢測(cè)各組給藥后第 1 d、第4 d、第 7 d 血樣的血清CRP含量。

1.3.4內(nèi)窺鏡檢查：用內(nèi)窺鏡在造模前、造模后及給藥后第 1 d、第 4 d、第7 d對(duì)試驗(yàn)犬結(jié)腸進(jìn)行觀察，記錄結(jié)腸黏膜潰瘍、潰爛和出血等情況。

2 結(jié)果

2.1 制備動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果內(nèi)窺鏡觀察可見：造模前犬結(jié)腸黏膜呈粉紅色，黏膜表面光滑，無病變。造模后犬結(jié)腸黏膜充血、水腫，有炎性彌漫性浸潤(rùn)，腸壁凸凹不平，形成潰瘍面，說明動(dòng)物模型制備成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1WBC檢測(cè)結(jié)果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，WBC為(23.825±3.113)×109/L；第 4 d為(24.275±4.182)×109/L；第7 d為(21.075±3.004)×109/L。(2)陽性藥物組給藥后第 1 d，WBC為(23.805±13.831)×109/L；第 4 d為(16.800±4.645)×109/L，恢復(fù)到正常范圍(6×109/L～17×109/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(13.550±2.767)×109/L。(3)正常劑量組給藥后第 1 d，WBC為(24.275±4.920)×109/L；第 4 d 為(21.823±7.889)×109/L；第7 d 為(18.050±0.893)×109/L。(4)2倍劑量組給藥后第 1 d，WBC為(25.000±12.884)×109/L；第 4 d為(11.250±5.540)×109/L，恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(10.600±2.688)×109/L，較正常劑量組、陽性藥物組差異極顯著(P<0.01)。見表1、圖1。血常規(guī)檢測(cè)WBC變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，根據(jù)是否存在差異顯著性，可反映藥物是否成功治療潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的臨床意義。結(jié)果表明：2倍劑量PK結(jié)腸溶膠囊效果最好。

表1 犬WBC檢測(cè)結(jié)果 ×109/L

注：各組間肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 犬WBC檢測(cè)柱形圖

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，無標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.2CRP檢測(cè)結(jié)果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，CRP為(103.775±16.747)mg/L；第4 d 為(97.600±29.676)mg/L；第7 d為(36.425±8.764)mg/L。(2)陽性藥物組給藥后第 1 d，CRP為(99.125±23.367)mg/L；第4 d 為(67.450±41.758)mg/L；第7 d為(14.500±2.783)mg/L。(3)正常劑量組給藥后第1 d，CRP為(93.575±17.547)mg/L；第4 d 為(60.125±18.164)mg/L；第7 d為(18.450±7.303)mg/L。(4)2 倍劑量組給藥后第 1 d，CRP為(103.675±28.430)mg/L；第4 d為(48.150±19.549)mg/L，較正常劑量組、陽性藥物組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(7.975±2.425)mg/L，恢復(fù)到正常范圍(1～10 mg/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)。見表2、圖2。CRP的檢測(cè)結(jié)果對(duì)藥物治療犬結(jié)腸炎療效的觀察具有臨床意義。CRP在乙酸誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)明顯增加，在給藥后第4 d、第7 d 隨炎癥消退而迅速下降。結(jié)果表明： 2倍劑量PK結(jié)腸溶膠囊效果最好。

表2 犬CRP檢測(cè)結(jié)果 mg/L

圖2 犬CRP檢測(cè)柱形圖

2.3WBC、CRP相關(guān)性分析結(jié)果各組相關(guān)方程式參考價(jià)值從高到低排序?yàn)椋赫┝拷M(r=0.998 2)>陰性藥物組(r=0.977 3)>陽性組(r=0.938 5)>2倍劑量組(r=0.924 4)。相關(guān)系數(shù)r的大小決定了WBC、CRP 2個(gè)變量相關(guān)的密切程度，當(dāng)r越接近1時(shí)，表示相關(guān)的方程式參考價(jià)值越高。結(jié)果表明：各組WBC和CRP呈正相關(guān)，均可作為犬結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)。

2.4 內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果

2.4.1給藥后第 1 d：陰性藥物組(見圖3a)結(jié)腸黏膜出血、彌漫性充血、色澤鮮紅；陽性藥物組(見圖3b)結(jié)腸黏膜屏障受損，組織細(xì)胞壞死導(dǎo)致黏膜面變粗糙；正常劑量組(見圖3c)結(jié)腸黏膜上形成點(diǎn)狀糜爛和多發(fā)性小潰瘍；2倍劑量組(見圖3d)結(jié)腸黏膜局部可見漿液彌漫性浸潤(rùn)。表明給藥后第 1 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效均不明顯。

2.4.2給藥后第 4 d：陰性藥物組(見圖4a)結(jié)腸黏膜水腫和充血依然可見，潰瘍?cè)钸吘夡w積基本沒有減小跡象；陽性藥物組(見圖4b)結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞粗糙、壞死，邊緣體積減小；正常劑量組(見圖4c)結(jié)腸黏膜水腫緩解，點(diǎn)狀糜爛腸黏膜開始愈合；2 倍劑量組(見圖4d)結(jié)腸黏膜局部滲出液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見。表明給藥后第 4 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組和陽性藥物組腸黏膜愈合程度大體一致。

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖3 給藥后第1 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組 圖4 給藥后第4 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

2.4.3給藥后第 7 d：陰性藥物組(見圖5a)結(jié)腸黏膜出血水腫情況有所減輕；陽性藥物組(見圖5b)及正常劑量組(見圖5c)結(jié)腸黏膜糜爛和潰瘍?cè)钜呀?jīng)完成組織細(xì)胞修復(fù)，依稀可見留下的痕跡；2倍劑量組(見圖5d)結(jié)腸黏膜色澤基本恢復(fù)正常，肉眼觀察無明顯病灶。表明給藥后第7 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組略好于陽性藥物組。

a.陰性藥物組 b.陽性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖5 給藥后第7 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

3 討論

3.1 乙酸致犬潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備本實(shí)驗(yàn)參考腸腔灌注法制作乙酸致犬急性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，是目前實(shí)驗(yàn)性UC模型中應(yīng)用最廣泛的模型之一，遵循了模型容易制備并且可以重復(fù)以及模型在病理上能反映疾病兩大要點(diǎn)。由于乙酸溶液的化學(xué)刺激，作為病理學(xué)致炎因子引起炎性充血和刺激性充血，發(fā)生充血的腸黏膜色澤鮮紅，炎灶邊緣體積輕度增大。因小血管壁的通透性增高，炎灶內(nèi)的微量液體成分通過血管基底膜緩慢滲出在腸黏膜上或者彌漫性浸潤(rùn)于腸黏膜上，可見漿液，局部炎性水腫并發(fā)生腸黏膜屏障受損、組織細(xì)胞壞死，形成潰瘍面。參考夏冰等[5]的研究，前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)試用4%、7%、10%乙酸溶液等不同濃度的實(shí)驗(yàn)試劑造模，從腸內(nèi)壁黏膜損傷情況是否容易觀察、能否有效指向研究目的等方面考慮，最終選擇7%乙酸溶液制備結(jié)腸炎臨床病例模型后，由胃腸鏡從肛門深入結(jié)腸，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎癥程度隨乙酸濃度增加而加重，而7%乙酸溶液既可導(dǎo)致犬結(jié)腸炎，又不致炎癥太重，前期試驗(yàn)結(jié)果符合夏冰等提出的最佳致炎濃度4%～8%的結(jié)論。

3.2CRP與犬的急性潰瘍性結(jié)腸炎C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein ，CRP)是1930年由Tillett首先在急性大葉性肺炎患者血清中所發(fā)現(xiàn)的1種蛋白質(zhì)，它在Ca2+存在下，同肺炎鏈球菌細(xì)胞壁上的 C多糖能飽和地結(jié)合在一起，發(fā)生沉淀反應(yīng)，故命名CRP。CRP是急性炎癥或組織嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)出現(xiàn)的1種異常蛋白質(zhì)，在急性炎癥時(shí)數(shù)小時(shí)內(nèi)明顯增加，1～3 d可達(dá)到最高值(增加100～3 000倍)，故又稱為“急性期蛋白”。本實(shí)驗(yàn)取犬頸靜脈血，用C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x分別檢查給藥后第1 d、第4 d、第7 d采集血樣的血清CRP含量，結(jié)果表明：陰性藥物組、正常劑量組、2倍劑量組、陽性藥物組CRP在乙酸誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)明顯增加，在給藥后第4 d及第7 d隨炎癥消退而迅速下降。在給藥后第1 d、第4 d、第7 d分別以內(nèi)窺鏡觀察腸道炎癥的范圍與程度，記錄炎癥發(fā)生后腸黏膜潰瘍的整個(gè)愈合過程，除陰性藥物組外，其他3組實(shí)驗(yàn)犬急性潰瘍性結(jié)腸炎疾病經(jīng)過的內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血清中CRP數(shù)據(jù)變化情況一致。CRP檢測(cè)結(jié)果快，操作更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，能真實(shí)反映犬結(jié)腸炎臨床癥狀的變化。CRP的檢測(cè)已經(jīng)在人醫(yī)的臨床廣泛應(yīng)用，包括急性感染性疾病的診斷和鑒別診斷、手術(shù)后感染的監(jiān)測(cè)、抗生素療效的觀察、病程檢測(cè)及預(yù)后判斷等[6]。故認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中CRP結(jié)果可以作為犬結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)之一。

3.3 內(nèi)窺鏡對(duì)犬結(jié)腸炎臨床診斷的臨床意義結(jié)腸鏡的適應(yīng)癥包括：原因不明的便血或者糞潛血陽性；臨床疑為結(jié)腸腫瘤；結(jié)腸疑有息肉，或者X射線檢測(cè)發(fā)現(xiàn)息肉需要鑒別良性或惡性者；各種原因的腹瀉、疑有潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病或者慢性痢疾，慢性結(jié)腸炎者；結(jié)腸手術(shù)后的復(fù)查及術(shù)前確定病變范圍者。只要臨床出現(xiàn)便血或者糞潛血陽性而原因不明時(shí)，就是結(jié)腸鏡檢查的適應(yīng)癥[7]。2012年廣州炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見正式明確了結(jié)腸鏡檢查并活檢是潰瘍性結(jié)腸炎診斷的主要依據(jù)[8]。由于犬潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀主要發(fā)生在黏膜當(dāng)中的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變，最主要的癥狀包括腹瀉、結(jié)腸直腸出血、黏液增多和腹痛。對(duì)犬的結(jié)腸炎臨床診斷時(shí)，利用內(nèi)窺鏡從肛門深入結(jié)腸即可直接觀察到結(jié)腸黏膜表面的組織變化。本實(shí)驗(yàn)是否成功建立乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎臨床動(dòng)物模型病例、口服給藥后各組實(shí)驗(yàn)犬結(jié)腸黏膜的愈合情況以及對(duì)PK結(jié)腸溶膠囊治療犬結(jié)腸炎的療效評(píng)價(jià)都與內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果密切相關(guān)，且在實(shí)驗(yàn)過程中能通過內(nèi)窺鏡對(duì)病變部位取活檢病理學(xué)檢查，對(duì)于提高動(dòng)物臨床確診率具有很大的意義。

3.4PK結(jié)腸溶膠囊治療犬結(jié)腸炎的療效

3.4.1造模給藥后第4 d內(nèi)窺鏡觀察：2倍劑量組腸炎灶內(nèi)滲出的液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見。通過血常規(guī)檢查：2倍劑量組WBC恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；CRP下降幅度為53.56%，較正常劑量組、陽性藥物組差異顯著(P<0.05)。說明對(duì)于犬結(jié)腸炎的臨床治療，PK結(jié)腸溶膠囊2倍劑量組治療效果更優(yōu)于正常劑量組。

3.4.2造模給藥后第7 d內(nèi)窺鏡觀察：2倍劑量組結(jié)腸黏膜已恢復(fù)到動(dòng)物健康時(shí)粉色帶正常光澤。血常規(guī)檢查：2 倍劑量組WBC恢復(fù)正常，較正常劑量組、陽性藥物組差異極顯著(P<0.01)；CRP也恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)，而陽性藥物組CRP尚未恢復(fù)正常。說明PK結(jié)腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結(jié)腸炎效果優(yōu)于柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊。

4 結(jié)論

4.1口服PK結(jié)腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結(jié)腸炎，治療期間CRP和WBC都顯著下降，2者呈正相關(guān)關(guān)系。

4.2CRP檢測(cè)結(jié)果可作為結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)。

4.3PK結(jié)腸溶膠囊以 2顆/kg劑量治療犬結(jié)腸炎療效明顯，其效果優(yōu)于1顆/kg的正常劑量和柳氮磺吡啶。