劉佩巖 王思瑩 郭紫婧 趙修華

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

杜仲(EucommiaulmoidesOlive.)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)多年落葉喬木，又名扯絲皮、絲聯(lián)木，是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種，同時(shí)也是國家珍貴的二類保護(hù)物種，其樹皮是我國名貴的滋補(bǔ)中藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓、利尿、安胎等藥用功效[1]，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，杜仲除了具有藥理作用的成分外，其中的皮、葉、根和種子中都富含白色絲狀杜仲膠(Eucommiaulmoidesgum，EUG)，杜仲膠是一種天然高分子物質(zhì)，其成分與東南亞的古塔波膠(gutta percha)和南美的巴拉塔膠(balata)一樣，均為反式-聚異戊二烯，但是天然的三葉橡膠為順式-聚異戊二烯[2]。杜仲膠存在于杜仲的樹葉、皮和種子中，成熟的杜仲籽中含有的杜仲膠最高，為10%～17%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，杜仲葉膠含量相對于杜仲皮和杜仲籽含量較低，理論上僅占杜仲葉干質(zhì)量的1.55%～3.23%[3]。

在此之前，工藝不成熟的時(shí)候，杜仲皮的獲取需要伐木取皮，即便現(xiàn)在研究出“杜仲剝皮再生技術(shù)”，可是畢竟受到了杜仲樹資源的限制。但是杜仲樹是落葉樹，每年秋季會(huì)掉落大量的落葉，屬于可再生資源，我國杜仲林現(xiàn)已有20余萬hm2，1 hm2杜仲林葉產(chǎn)膠量約為150 kg[4]，因此杜仲葉不僅可以加工成保健茶，還可以利用其作為提取杜仲膠的主要原料，這很大程度上提高了杜仲的生態(tài)環(huán)境利用價(jià)值，使其成為一種具有潛力的天然資源[5～6]。

目前從杜仲植物組織中提取杜仲膠的一般方法主要有機(jī)溶劑浸提法如:苯、甲苯、石油醚、正己烷，還有植物細(xì)胞壁破除法如:纖維素酶處理、堿處理、機(jī)械力處理這兩類[7]。魏錦錦等[8]應(yīng)用蒸汽爆破預(yù)處理杜仲皮來提取其中的杜仲膠與其他活性成分；周鵬等[9]在鹽酸作為催化劑的條件下運(yùn)用乙酸預(yù)處理杜仲果殼從而提取杜仲膠；劉貴華等[10]直接應(yīng)用纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而從杜仲粕殼提取杜仲膠；謝曉婷等[11]用堿水解和酶解預(yù)處理杜仲葉渣，之后用石油醚作為溶劑提取杜仲膠。對于從杜仲植物組織中提取杜仲膠的研究還有很多，但是都存在應(yīng)用有機(jī)溶劑用量大、用料成本高、實(shí)驗(yàn)安全低，等諸多不足之處，所以在杜仲膠的提取工藝上還是要進(jìn)行一些改進(jìn)，本研究從原料的來源、工藝的安全、工藝流程綠色環(huán)保等各個(gè)方面，研究探索一種利用從杜仲葉中提取杜仲膠的方法，對杜仲葉的綜合開發(fā)利用有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

杜仲葉:產(chǎn)自安徽亳州，曬干后保存。綠色木霉:購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 杜仲葉烘干

將已購的杜仲葉放置于50～60℃的烘箱中鼓風(fēng)干燥12 h左右。

1.2.2 杜仲葉面角質(zhì)層的去除

根據(jù)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]，NaOH的稀溶液能較好溶解角質(zhì)層，同時(shí)NaOH的稀溶液對杜仲葉纖維素?zé)o作用，所以選用NaOH的稀溶液預(yù)處理杜仲葉的角質(zhì)層。選用在75℃下、0.45%的NaOH、料液比1∶14、時(shí)間為120 min條件下可以對杜仲葉的角質(zhì)層有很好的去除效果。而且蘇丹Ⅲ染色劑對植物的角質(zhì)層有很好的染色效果，因此可以以此作為判定杜仲葉角質(zhì)層是否去除完全的判定依據(jù)。

1.2.3 綠色木霉菌種活化與菌懸液的制備

按照菌種培養(yǎng)說明書，配置綜合馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，制成平板培養(yǎng)基，在無菌工作臺(tái)接種，在28℃下培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)出菌絲綠色、生長健壯、濃密、無污染的菌種，放置于2～8℃環(huán)境中保存，為之后制備菌懸液做準(zhǔn)備。斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為:CMC-Na(7.5 g)，蛋白胨(5 g)吐溫-80(2 mL)，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2(0.3 g)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.005 g)，MnSO4·H2O(0.001 6 g)，ZnSO4·7H2O(0.001 4 g)，CoCl2(0.002 g)，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃，滅菌20 min[12]。合成培養(yǎng)液。基質(zhì)溶液成分為:NaCl(0.5 g·L-1)，MgSO4(0.5 g·L-1)，(NH4)2SO4(13 g·L-1)，KH2PO4(10.5 g·L-1)，CaCl2(0.3 g·L-1)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.01 g·L-1)，MnSO4·7H2O(0.015 g·L-1)，ZnSO4·7H2O(0.015 g·L-1)，CoCl2(0.01 g·L-1)[13～17]。

菌懸液的制備。種子搖瓶培養(yǎng)。在250 mL三角瓶中加入100 mL種子培養(yǎng)基，取已活化的綠色木霉菌種一環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 綠色木霉培養(yǎng)條件的優(yōu)化

表1 綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)正交試驗(yàn)因素及水平

Table 1 Orthogonal test factors and levels of green trichoderma fermentation culture

水平LevelpH(A)固液比(B)Solid-liquid ratio接種量(C)Quantity of inoculation(%)時(shí)間(D)Time141∶10203251∶20255361∶50307

1.2.5 纖維素酶活力的測定與計(jì)算

用移液管準(zhǔn)確吸取0.2 mL粗酶液于試管中，再加入已用pH=5.0的NaAC-HA緩沖液配置好的CMC-Na溶液1.8 mL，55℃水浴30 min，然后加2 mL DNS試劑，混勻并在沸水浴中水浴5 min，放置至室溫，定容到25 mL后于540 nm下測定其吸光值。最后按照DNS法測定還原糖量，再根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算纖維素酶的活力，單位酶活的計(jì)算如下:

(1)

式中：OD為酶液的吸光值；K為曲線斜率；n為稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間(min)；1 000為mg換算成μg。

1.2.6 杜仲膠得率與含量及純度的計(jì)算

取的杜仲葉樣品5 g，置于250 mL燒杯中。加入100 mL石油醚，在85℃下攪拌提取1次(測定杜仲葉中杜仲膠的含量時(shí)提取次數(shù)為3～5次)，趁熱過濾，將燒杯放入-20℃環(huán)境中冷凍，待2 h左右后有白色沉淀析出，進(jìn)行過濾，獲得杜仲粗膠，最后將杜仲膠粗品中加入丙酮溶液加熱回流2 h即可得到杜仲膠純品。過濾取沉淀在50～60℃鼓風(fēng)干燥，獲得杜仲膠精膠。將濾液裝入500 mL圓底燒瓶中在55℃下減壓蒸餾，進(jìn)行溶劑回收。提取完成之后，回收得到的石油醚可以重復(fù)利用于杜仲膠的提取。提取得率與含量的計(jì)算方法如下：

(2)

式中：η為杜仲葉樣品中杜仲膠提取得率(%);W1為最后得到杜仲葉樣品中杜仲膠的質(zhì)量(g);W0為杜仲葉樣品的總質(zhì)量(g)。

參照GB/T8086-2008《天然生膠雜質(zhì)含量的測定》[18]測定。將所得杜仲膠分析天平準(zhǔn)確稱取m0，用干凈干燥的三角燒瓶承裝備用，向三角燒瓶中加入適量含有2-硫醇基苯并噻唑的橡膠溶劑，通過加熱溶解樣品。然后用干燥后已知恒m1的孔徑為45 μm的濾篩過濾。最后，將裝有雜質(zhì)的濾篩用石油醚浸泡15～20 min后取出瀝干，放置烘箱中烘干稱重m2。雜質(zhì)含量的計(jì)算公式如下：

(3)

式中：m0為杜仲膠樣品的質(zhì)量(g)；m1為空篩的質(zhì)量(g)；m2為空篩和雜質(zhì)的總質(zhì)量(g)。

1.2.7 杜仲葉表面SEM觀測

選取適量的樣品，在50～60℃鼓風(fēng)干燥備用。將上述烘干后的杜仲葉樣品通過導(dǎo)電膠粘到掃描電鏡樣品臺(tái)上。將附有樣品的樣品臺(tái)放置于BC-Ⅱ離子濺射儀中進(jìn)行真空噴鍍，噴鍍時(shí)金靶材處于陰極，調(diào)整靶材和樣品臺(tái)合適的距離。電鏡觀察前處理完成后，放入場發(fā)射掃描電子顯微鏡中(型號(hào)為SU-8000 Hitachi)；嚴(yán)格按照掃描電鏡的觀測步驟調(diào)節(jié)燈絲飽和點(diǎn)、光闌對中、光闌合軸、消象散調(diào)節(jié)和聚焦觀測等步驟，選擇合適的倍數(shù)觀察，可獲得清晰的杜仲葉微觀表面形貌圖像。

1.2.8 杜仲膠的紅外光譜測定

對最終得到的杜仲膠進(jìn)行紅外光譜的測定:由于制得的杜仲膠呈固體狀態(tài)，故把得到的杜仲膠精膠粉碎，準(zhǔn)確稱取1 mg杜仲精膠，研磨成細(xì)粉采用壓片法與200 mg KBr混合壓片。通過傅里葉紅外光譜儀在波長為全波，掃描次數(shù)為35次，分辨率為2.0 cm-1，測定方式為Interferogram、條件下對所得的杜仲膠做紅外光譜的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面角質(zhì)層去除效果

以未經(jīng)預(yù)處理的杜仲葉制備培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)現(xiàn)綠色木霉菌絲生長緩慢甚至不生長，對杜仲葉進(jìn)行烘干后稱重對比處理前重量也沒有明顯差異。間接說明綠色木霉直接與杜仲葉作用時(shí)，杜仲葉細(xì)胞壁未被破壞;用蘇丹Ⅲ對杜仲葉進(jìn)行顯色表征，發(fā)現(xiàn)表面被染成紅色(圖1:A)，說明杜仲葉表面覆蓋有一層角質(zhì)層，角質(zhì)層阻礙了綠色木霉對杜仲葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。說明此條件提高了角質(zhì)層的溶解效果，并且在應(yīng)用稀堿溶液預(yù)處理的過程中，不僅溶解掉杜仲葉的角質(zhì)層和表面的蠟質(zhì)，也一定程度上除去了杜仲葉中的一些雜質(zhì)，間接提高了杜仲膠在杜仲葉中的含量，為之后的提取做準(zhǔn)備。同時(shí)，用蘇丹Ⅲ對優(yōu)化條件下稀NaOH溶液作用后的杜仲葉進(jìn)行顯色反應(yīng)，在100倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的杜仲葉相比，稀堿處理后的杜仲葉經(jīng)蘇丹Ⅲ染色(圖1:B)，沒有染成紅色，可以說明角質(zhì)層去除比較完全。

圖1 蘇丹Ⅲ染色100倍顯微鏡下觀察杜仲葉表面Fig.1 Sudan Ⅲ staining observed the surface of E.ulmoides leaves under a microscope at 100 times

圖2 杜仲葉原葉、稀堿處理、綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)的SEM結(jié)果Fig.2 SEM results of primary leaves of E.ulmoides,dilute alkali treatment and green trichoderma fermentation culture

2.2 杜仲葉表面SEM觀測

通過對稀堿與綠色木霉聯(lián)合處理后的杜仲葉進(jìn)行SEM觀察可以很清楚的發(fā)現(xiàn)，杜仲葉的表面由比較平整、雜質(zhì)較多的狀態(tài)(圖2:A)，變成粗糙(圖2:B)、疏松多孔(圖2:C)的狀態(tài)，可以證明稀堿聯(lián)合綠色木霉預(yù)處理杜仲葉是一種比較有效的方法。

2.3 綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)及條件優(yōu)化

2.3.1 綠色木霉培養(yǎng)

由圖3可知，圖3A為搖床震蕩液體培養(yǎng)之前的狀態(tài)，圖3B為經(jīng)過搖床震蕩培養(yǎng)之后的狀態(tài)，可以清楚的看到培養(yǎng)基中有明顯的菌團(tuán)出現(xiàn)?？梢宰C明在此培養(yǎng)基下綠色木霉可以旺盛的生長。為了在此驗(yàn)證綠色木霉在此培養(yǎng)基條件下生長情況，與液體培養(yǎng)同樣培養(yǎng)基比例條件下，進(jìn)行綠色木霉的平板培養(yǎng)，如圖4所示，可以菌落生長極其旺盛，且呈現(xiàn)綠色木霉的特征菌落，進(jìn)而證明此培養(yǎng)基利于綠色木霉的生長。

2.3.2 綠色木霉培養(yǎng)條件優(yōu)化

由表2可知，4個(gè)因素對綠色木霉發(fā)酵效果的影響順序?yàn)閜H>固液比>接種量>時(shí)間。最優(yōu)的水解水平為A3B1C1D2，即培養(yǎng)基pH=6，固液比1:10，接種量為20%，酶作用時(shí)間為5 d。最優(yōu)條件下，測得綠色木霉的酶活性為19.883 U·mL-1，失重率達(dá)到27.5%，杜仲膠含量提升到4.36%，高于正交試驗(yàn)中任何一個(gè)條件結(jié)果，說明該優(yōu)化組合得出了一個(gè)綠色木霉發(fā)酵最佳條件。

圖3 綠色木霉液體培養(yǎng)狀態(tài)Fig.3 Liquid culture status of green trichoderma

圖4 綠色木霉平板培養(yǎng)狀態(tài)Fig.4 Status of green trichoderma in plate culture

表2 綠色木霉正交試驗(yàn)與結(jié)果

2.4 有機(jī)溶劑對杜仲膠的提取

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示[19]，石油醚可以很好的溶解杜仲膠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在溫度為85℃、料液比為1∶20、提取次數(shù)為1次、每次提取時(shí)間為60 min、石油醚作為提取溶劑的條件下，對杜仲葉中的杜仲膠直接提取，杜仲膠的提取率僅為0.73%的杜仲膠。而經(jīng)過稀堿溶液與真菌聯(lián)合預(yù)處理后，杜仲膠的提取率可以達(dá)到2.85%，這是可能是因?yàn)橥ㄟ^稀堿聯(lián)合綠色木霉預(yù)處理杜仲葉，不僅可以破壞其本身的纖維結(jié)構(gòu)，也使得杜仲葉的纖維結(jié)構(gòu)變得疏松、多孔有利于溶劑的滲透、增大提取效率，而且因?yàn)槎胖偃~的質(zhì)量的缺少，間接的提高了杜仲膠的含量，并且通過計(jì)算可以得出提取單位質(zhì)量下的杜仲膠所需要的溶劑的量，為杜仲原葉的2.74 mL·mg-1，而預(yù)處理后僅為0.70 mL·mg-1，減少了石油醚的用量，以此達(dá)到既能獲得高純度的杜仲膠，又能使提取過程安全、環(huán)保的目的。

表3 預(yù)處理前后杜仲膠提取的對比

2.5 杜仲葉中的杜仲膠紅外光譜的測定結(jié)果

對用丙酮純化后得到的白色杜仲膠進(jìn)行傅里葉紅外光譜(FT-IR)的測定，獲得光譜圖如圖5所示，將其與文獻(xiàn)[20]進(jìn)行對比可知，實(shí)驗(yàn)所得杜仲膠譜圖與文獻(xiàn)中所描述的值近乎相同，呈現(xiàn)為反式1，4-聚異戊二烯圖譜，在2 854和2 918 cm-1處為甲基的伸縮振動(dòng)，2 848 cm-1處為亞甲基的伸縮振動(dòng)，1 669 cm-1處表示存在碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)，在800～1 500 cm-1范圍內(nèi)還有較多吸收峰，表示碳?xì)滏I、碳碳單鍵及甲基和亞甲基的振動(dòng)及振動(dòng)之間的耦合[20]。

圖5 所得杜仲膠的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of gutta-percha obtained

3 討論

結(jié)果表明，最佳的提取條件為：干燥的杜仲葉經(jīng)過0.45% NaOH去除角質(zhì)層并且同時(shí)溶出杜仲葉中的一些可溶解性的雜質(zhì)，之后在pH=6、溫度為28℃搖床培養(yǎng)下利用綠色木霉破壞細(xì)胞壁纖維素，發(fā)酵5天后，剩余物質(zhì)干燥箱中鼓風(fēng)干燥，再通過石油醚在溫度為85℃、料液比為1∶20、提取次數(shù)為1次、提取時(shí)間為60 min提取出杜仲膠，最后，與有機(jī)溶劑直接提取杜仲膠相比，經(jīng)過稀堿與綠色木霉聯(lián)合處理后，首先，除去了杜仲葉表面的角質(zhì)層，使綠色木霉可以更好的作用于杜仲葉本身，其次經(jīng)稀堿預(yù)處理后的杜仲葉中的可溶性雜質(zhì)更少，可以使得出的杜仲膠的純度更高，最后經(jīng)過稀堿與綠色木霉預(yù)處理后的杜仲葉，其結(jié)構(gòu)更加的疏松，這樣可以使石油醚更好的滲透進(jìn)杜仲葉的內(nèi)部，增大了溶劑于杜仲膠的接觸面積，可以更好的提取出杜仲膠。此外，完整的杜仲葉經(jīng)過稀堿與綠色木霉處理后，其中的木質(zhì)素含量幾乎無變化，其中的纖維素與半纖維素變化最為明顯，由預(yù)處理前25.65%、18.36%，變化為13.81%、8.35%，脫除率均達(dá)到50%，再結(jié)合SEM的觀察結(jié)果可以證明預(yù)處理是很有效的。最后將直接石油醚浸提杜仲葉中的杜仲膠與真菌聯(lián)合稀堿預(yù)處理的再由石油醚總得率由0.73%，提升到2.85%，其杜仲膠含量由1.78%，增加到4.36%。但是在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中利用微生物進(jìn)行預(yù)處理的工藝還是不夠成熟會(huì)有有很多的弊端，因此，實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)適合的情況選擇提取條件。