王永輝，奇錦峰，孫晨

（1. 河南省駐馬店市中心醫(yī)院藥學部，河南 駐馬店 463000；2. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院藥理學教研室，廣東 廣州 510006）

中藥柴胡為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根，有解熱抗炎、保肝及免疫調節(jié)等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，目前發(fā)現有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[1]。葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）和硫酸轉移酶（SULT）是Ⅱ相代謝酶的主要成員，對很多藥物的Ⅱ相代謝具有重要的作用[2]。國外有研究發(fā)現十字花科蔬菜（如卷心菜、洋白菜等）中所含的吲哚能增加UGT活性進而促進奧沙西泮和撲熱息痛的葡萄糖醛酸反應[6]。柴胡在國內應用廣泛，然而柴胡總皂苷對Ⅱ相代謝酶的影響尚無研究報道。本文主要探討柴胡總皂苷（total saikosaponins，TSS）對小鼠UGT1A1和SULT1A1活性及mRNA表達的影響，為臨床相關研究或藥物治療提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

NIH小鼠（SPF級），體質量18～26g [廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號SCXK（粵 2008-0020），粵監(jiān)證號：2008A003]。由實驗動物專用飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑

柴胡總皂苷（含量≥85%，昆明科翔生物有限公司）；3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸（Sigma）；2-萘酚硫酸鹽（Sigma）；4-硝基苯酚硫酸鹽（Sigma）；Brandford 蛋白定量試劑盒（上海杰美基因有限公司）；RT-PCR試劑（TaKaRa公司）。

1.3 儀器

低溫高速離心機（Thermo 電子公司）；G7-953T型組織勻漿機（As One，日本）；紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器公司）；實時熒光定量PCR儀（ABI7500，USA）；核酸蛋白檢測儀（BIO-RAD Laboratories，USA）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥

將30只小鼠隨機分為3組，雌雄各半。分別為純水組（10 mL/kg）、柴胡總皂苷（TSS）高、低劑量組（給藥劑量分別為150 mg/kg、50 mg/kg）。連續(xù)灌胃7 d，每天2次。

2.2 肝微粒體和胞質液制備

小鼠肝臟微粒體和胞漿液的制備依據文獻方法進行[3]。最終所得肝微粒體用于測定UGT1A1活性，肝胞漿液測定SULT1A1活性。以Bradford法測定胞漿液和微粒體中的蛋白含量。

2.3 小鼠肝臟UGT1A1活性測定

UGT1A1活性測定依據文獻進行[4]，反應體系于540 nm處測吸光度值，以苯胺濃度為橫坐標，OD值為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線：

2.4 小鼠肝臟SULT1A1活性測定

SULT1A1活性測定參考文獻方法進行[5]。以4-硝基酚（或2-萘酚）硫酸鹽濃度值為橫坐標，OD值為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程（線性范圍0.0625～2.5 μmol/mL）：① 4-硝基酚硫酸鹽 ：

② 2-萘酚硫酸鹽：

2.5 實時定量PCR分析

小鼠肝臟總RNA提取和RT-PCR反應按試劑盒說明書進行。PCR引物根據文獻[6]設計（見表1）。PCR反應每個樣品進行3次重復實驗，PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性30 s，然后進入循環(huán)階段，每個循環(huán)包括95 ℃變性15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 31 s，共 40 個循環(huán)。最后以目的基因與GAPDH的含量比值表示目的基因的表達水平，計算供試物組小鼠與純水組小鼠中目的基因表達水平的比值。

2.6 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數據，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 UGT1A1活性測定

柴胡總皂苷高、低劑量組小鼠肝臟UGT1A1活性與純水組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示其對小鼠肝臟UGT1A1活性不具有影響。見表2。

表1 實時熒光定量PCR實驗的引物序列

表2 小鼠肝臟UGT1A1活性測定結果

3.2 SULT1A1活性測定

分別以2-萘酚和4-硝基酚為底物測定小鼠肝臟SULT1A1酶活性，柴胡總皂苷高、低劑量組小鼠SULT1A1活性均高于純水組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 小鼠肝臟SULT1A1 活性測定結果

3.3 小鼠肝臟UGT1A1 mRNA表達

UGT1A1基因表達測定中，柴胡總皂苷高劑量組與純水組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明TSS對UGT1A1 mRNA的表達沒有影響。

圖1 各組小鼠肝臟UGT1A1 mRNA表達量的比較

3.4 小鼠肝臟SULT1A1 mRNA表達

SULT1A1基因表達測定中，柴胡總皂苷高劑量組高于純水組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。說明TSS對SULT1A1 mRNA表達有明顯的誘導效應。

圖2 各組小鼠肝臟SULT1A1 mRNA表達量的比較

4 討論

UGT1A1在整個UGT家族中具有重要意義，主要參與體內膽紅素和部分化合物（酚類、蒽醌類、黃酮類等化合物）的葡萄糖醛酸化反應；SULT1A1主要參與酚類化合物如4-硝基酚、2-萘酚、芳香胺等物質的硫酸化反應。在測定小鼠SULT1A1活性時，本研究分別以4-硝基酚和2-萘酚為底物測定酶活性，使兩種底物的測定結果相互驗證，增加了檢測結果的可靠性。雖然柴胡總皂苷對小鼠肝臟UGT1A1活性沒有影響，但對SULT1A1活性的誘導作用、對增加某些藥物的硫酸化反應，促進其排泄具有積極意義。

本研究證明柴胡總皂苷對小鼠SULT1A1活性和mRNA表達具有一定的誘導作用，可能促進某些藥物在體內的硫酸化反應，因此在臨床用藥期間應重視柴胡總皂苷對其它合用藥物在體內代謝的影響，避免藥物之間相互作用。