徐磊 孫博懌 盛鵬程

摘要：在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗菌藥物作為防治細(xì)菌性疾病的藥物和生長(zhǎng)促進(jìn)劑被大量的應(yīng)用，不可避免地造成了抗菌藥物在水環(huán)境中的殘留，引發(fā)一系列環(huán)境問(wèn)題。利用固相萃取和超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)調(diào)查6種磺胺類、4種四環(huán)素類和6種喹諾酮類抗菌藥物在湖州地區(qū)典型水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的含量水平，揭示其在湖州地區(qū)典型水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的污染現(xiàn)狀與分布特征。在養(yǎng)殖水、底泥中分別檢測(cè)到9、13種抗菌藥物，平均濃度在0.1～428.8、10.0～3 681.6 ng/kg 之間，其中養(yǎng)殖水中以磺胺類為主，底泥中以四環(huán)素類和喹諾酮類為主。抗菌藥物在底泥和水中的分布可采用底泥-水分配系數(shù)（Kd）來(lái)解釋分析。在不同養(yǎng)殖模式下，抗菌藥物的污染程度存在巨大差異。

關(guān)鍵詞：抗菌藥物;水;底泥;水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū);湖州地區(qū);分配系數(shù);污染特征

中圖分類號(hào)：X171.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0210-05

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗菌藥物在促生長(zhǎng)、預(yù)防和治療感染性疾病方面被廣泛使用，為動(dòng)物的快速、健康生長(zhǎng)作出了重要貢獻(xiàn)[1]。然而，抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大量使用，不可避免地造成了抗菌藥物在水環(huán)境中的殘留，研究表明養(yǎng)殖塘中有70%～80%的抗菌藥物最終進(jìn)入環(huán)境[2]。梁惜梅等在珠江口水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)的水和沉積物中分別檢測(cè)出2類3種（諾氟沙星、氧氟沙星和四環(huán)素）和3類5種（諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素和脫水紅霉素）抗菌藥物殘留，平均質(zhì)量濃度分別在7.63～59.00、0.97～85.25 ng/g之間[3]。大量的抗菌藥物進(jìn)入到水環(huán)境中可能會(huì)引發(fā)多種危害，其中一個(gè)危害就是誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)抗菌藥物的抗性基因。楊穎發(fā)現(xiàn)，含有四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的細(xì)菌在珠江流域的北江水體中普遍存在，抗性基因在環(huán)境中的存在與傳播將可能導(dǎo)致人類本體攜帶上抗性基因，并最終危害人類健康[4]。

湖州地區(qū)是全國(guó)著名的淡水漁業(yè)基地，各類養(yǎng)殖水域達(dá)到426.67 km2。近年，年生產(chǎn)各類水產(chǎn)品15萬(wàn)t，產(chǎn)值約20億元。然而，對(duì)于湖州地區(qū)養(yǎng)殖水域中抗菌藥物污染的研究較為鮮見(jiàn)，缺乏足夠的研究基礎(chǔ)。本研究將以湖州3縣2區(qū)9個(gè)養(yǎng)殖品種、18個(gè)養(yǎng)殖塘為研究對(duì)象，調(diào)查了6種磺胺類、4種四環(huán)素類和6種喹諾酮類在養(yǎng)殖水和底泥中的含量水平，分析其中抗菌藥物的組成及分布特征，以了解湖州地區(qū)養(yǎng)殖塘中抗菌藥物的殘留狀況，以期為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)中抗菌藥物使用和殘留的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQ MS/I-CLASS系列美國(guó)Waters公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司），氮吹儀（美國(guó)Orgnomation公司），冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司），固相萃取裝置（美國(guó)SUPELCO公司）。

磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺多辛（SDX）、磺胺異唑（SFZ）、磺胺甲基異唑（SMZ）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、四環(huán)素（TC）、強(qiáng)力霉素（DXC）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、培氟沙星（PEF）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFLX）、司帕沙星（SPA），內(nèi)標(biāo)物：氘代磺胺多辛-D3（SDX-D3）、氘代諾氟沙星（NOR-D5）、氘代恩諾沙星（ENR-D5），均來(lái)自德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司。

Oasis HLB固相萃取小柱（225 mg，Oasis HLB Plus Short cartridges，美國(guó)Waters公司），SAX陰離子交換小柱（360 mg，Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Short Cartridge，美國(guó)Waters公司）。

1.2 樣品采集

選定湖州3縣2區(qū)共計(jì)14個(gè)點(diǎn)（圖1），共計(jì)18個(gè)養(yǎng)殖塘，包含外塘甲魚、溫室甲魚、黑魚、加州鱸、青魚、泥鰍、黃顙魚、中華絨螯蟹、青蝦9個(gè)品種，每個(gè)品種各2個(gè)養(yǎng)殖塘，其中黑魚和加州鱸分別選擇2種養(yǎng)殖模式，分別投喂的是飼料和冰鮮（雞、鴨內(nèi)臟）。于2016年4、8、11月3個(gè)季度采集18個(gè)養(yǎng)殖塘中的養(yǎng)殖水與底泥樣本，水源水與水源底泥樣本。每個(gè)采樣點(diǎn)均在養(yǎng)殖塘的四角及中央各采集水樣2 L，將10 L水混勻后，取1 L裝于樣品瓶中，加200 μL鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0左右;同樣地點(diǎn)采集底泥樣品，混勻后取約200 g裝入樣品袋中。所有樣品采集至實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱中存放。

1.3 樣品處理

水樣采集后24 h內(nèi)經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)。取500 mL已過(guò)濾水（溫室甲魚的養(yǎng)殖水取100 mL），加入內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，利用225 mg/Oasis HLB Plus Short cartridges小柱（小柱上方接50 mL注射針筒）進(jìn)行固相萃取富集。上樣前，HLB柱依次用5 mL甲醇和5 mL超純水進(jìn)行活化平衡;上樣時(shí)，流速控制在5～8 mL/min;上樣后，用10 mL超純水淋洗HLB柱，負(fù)壓抽干后置于冷凍干燥機(jī)中干燥10 min;最后用6 mL甲醇經(jīng)行洗脫，收集洗脫液并在40 ℃下采用氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相（15%乙腈、7%甲醇、78%水）定容至1.0 mL。

底泥樣品經(jīng)冷凍干燥24 h后，研磨后過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取2.00 g底泥置于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻1 min，靜置1 h后依次加入0.4 g Na2EDTA、5.0 mL 乙腈、5.0 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH值為3）。渦旋混勻1 min，搖床振蕩20 min，超聲波提取10 min，離心后收集上清液，殘留物重復(fù)提取2次后，合并3次上清液，加入超純水，稀釋至約400 mL，混勻后過(guò)SAX-HLB串聯(lián)小柱，上樣前，SAX-HLB串聯(lián)柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水和 5 mL 磷酸緩沖液活化平衡;上樣時(shí)，將稀釋水樣流速控制在5～8 mL/min;上樣后，將上層SAX柱取下后用10 mL超純水淋洗HLB柱，負(fù)壓抽干后置于冷凍干燥機(jī)中干燥10 min;最后用6 mL甲醇經(jīng)行洗脫，收集洗脫液并在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容至1.0 mL。

1.4 方法回收率和質(zhì)量控制

喹諾酮類和磺胺類采用內(nèi)標(biāo)法經(jīng)行定量分析，四環(huán)素類采用外標(biāo)法經(jīng)行定量分析。以養(yǎng)殖水和底泥為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，500 mL水和2.00 g底泥分別加入25 ng和10 ng混合標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比（S/N）≥3作為方法的最低檢出限。養(yǎng)殖水中抗菌藥物的回收率為59.45%～109.20%，底泥中抗菌藥物的回收率為63.13%～118.50%，養(yǎng)殖水中抗菌藥物的檢出限為2.5～10.0 ng/L，底泥中抗菌藥物的檢出限為0.25～1.00 ng/g（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌藥物的存在與含量

由表2可知，16種抗菌藥物在湖州地區(qū)典型水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的含量水平。在16個(gè)養(yǎng)殖池塘（由于溫室甲魚的特殊養(yǎng)殖模式，在采集過(guò)程中并未采集到底泥，因此并未計(jì)入統(tǒng)計(jì)中）3個(gè)季度的采樣檢測(cè)中，在養(yǎng)殖水和池塘底泥中共檢測(cè)到15種抗菌藥物，其中養(yǎng)殖水中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺甲基異唑的檢出率較高。底泥中四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素、恩諾沙星、氧氟沙星和培氟沙星的檢出率較高。表明在湖州地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中殘留了多種類型的抗菌藥物。

養(yǎng)殖水中有5種抗菌藥物的檢出率在9.1%以上，其中氧氟沙星平均濃度為0.9 ng/L，磺胺甲基異唑平均濃度為 1.6 ng/L，恩諾沙星平均濃度為10.4 ng/L，相比之下，磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶無(wú)論是檢出率（29.5%、20.5%）還是平均濃度（428.8、23.0 ng/L）均要高出其他抗菌藥物不少，尤其是磺胺嘧啶。池塘底泥中四環(huán)素類和3種喹諾酮類抗菌藥物均有較高的檢出率（≥13.6%）和平均濃度（126.0～3 681.6 ng/kg）。由此得出，磺胺類的水溶性強(qiáng)，而四環(huán)素類和喹諾酮類在底泥沉積物中有較強(qiáng)的吸附性，這與其他文獻(xiàn)中的研究結(jié)果[5-6]一致。

由表2的中位值所示，湖州地區(qū)典型水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中，養(yǎng)殖水中的抗菌藥物濃度為0.0～190.0 ng/L，底泥中的抗菌藥物濃度為0.00～17.51 μg/kg。

2.2 抗菌藥物的分布

抗菌藥物在水與底泥之間的分布與其自身極性、憎水性和空間結(jié)構(gòu)等有關(guān)。通常污染物在底泥中的吸附能力可通過(guò)常用的土壤水分配系數(shù)Kd來(lái)表示，Kd=Cs/Cw，Kd值越大，表示吸附作用越強(qiáng)，其中Cs、Cw分別為吸附平衡時(shí)固相和液相中污染物的濃度，在本研究中單位分別為ng/kg、ng/L。

由表2可知，在一個(gè)中華絨螯蟹的養(yǎng)殖水中，測(cè)得夏季池塘中磺胺嘧啶的濃度達(dá)到了11 907.5 ng/L，不僅遠(yuǎn)高于平均濃度， 而且也遠(yuǎn)高于其春季（未檢出）與秋季（428.6 ng/L）的濃度，即便是與其他養(yǎng)殖水域比較也是大大高出其濃度[3]。若不考慮這一極端值，將養(yǎng)殖水中含有磺胺嘧啶的養(yǎng)殖池塘作為一組研究對(duì)象，計(jì)算養(yǎng)殖水中磺胺嘧啶平均值為 535.5 ng/L，同理，將底泥中含有磺胺嘧啶的養(yǎng)殖池塘作為另一組研究對(duì)象，計(jì)算底泥中磺胺嘧啶平均值為 1 877.0 ng/kg。用這2個(gè)平均值來(lái)計(jì)算磺胺嘧啶的Kd值為3.51 L/kg。該Kd值與傳統(tǒng)意義上的明確固相和液相而得到Kd值并不相同，其代表著湖州地區(qū)受磺胺嘧啶污染的養(yǎng)殖池塘中磺胺嘧啶的底泥水分配系數(shù)。該Kd值與郭欣妍擬合得到的磺胺嘧啶在5種土壤中吸附的Kd值為0.41～2.02 L/kg[7]相近。同樣的方法計(jì)算得到磺胺二甲基嘧啶、培氟沙星、恩諾沙星等其他8種高檢出率抗菌藥物的Kd值，其中養(yǎng)殖水中未檢出的抗菌藥物，其平均值取最低檢出限，并與其他文獻(xiàn)中試驗(yàn)得到的Kd值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

本研究中3個(gè)季度共采集水樣44個(gè)，四環(huán)素類抗菌藥物中僅測(cè)到過(guò)1次金霉素，濃度為5.6 ng/L，這是由于四環(huán)素類具有較高的Kd值，與底泥表現(xiàn)出較好的親和力，易通過(guò)陽(yáng)離子鍵橋、表面配位螯合以及氫鍵等作用機(jī)制吸附在底泥中[8-12];另外，王麗平等研究發(fā)現(xiàn)，自然光對(duì)土壤中的抗菌藥物降解影響要遠(yuǎn)大于微生物對(duì)抗菌藥物降解的影響，其中對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物降解的影響最為顯著[10]。相比于底泥中的四環(huán)素類抗菌藥物，養(yǎng)殖水中的四環(huán)素類抗菌藥物更容易受到自然光的影響，因而降解得較為徹底。由于養(yǎng)殖水中的四環(huán)素類抗菌藥物過(guò)低的檢出率使得其計(jì)算得到的Kd值準(zhǔn)確性有所降低，但整體而言，通過(guò)抗菌藥物在養(yǎng)殖水和底泥中的平均值計(jì)算得到的Kd值與文獻(xiàn)中得到的Kd依然較為相近，尤其是當(dāng)數(shù)據(jù)較為充足時(shí)，如磺胺類抗菌藥物和喹諾酮類抗菌藥物。

由表3可知，四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物的Kd值要遠(yuǎn)大于磺胺類抗菌藥物的Kd值，這是由抗菌藥物本身的性質(zhì)所決定的。崔皓等研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物的吸附機(jī)理主要為陽(yáng)離子交換吸附，由于四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物的分子中含有較多的極性/離子型官能團(tuán)，因此在底泥中有較強(qiáng)的吸附性[13]。而磺胺類抗菌藥物只含有苯胺基和酰胺基2個(gè)離子型官能團(tuán)，吸附能力很弱。此外，陳昦等研究發(fā)現(xiàn)，磺胺類抗菌藥物在土壤中的吸附以物理吸附為主，由于物理吸附的作用力主要是分子間的范德華力，吸附能小，被吸附的物質(zhì)很容易脫離[14]。

過(guò)低的Kd值，表明了磺胺類抗菌藥物的水溶性大以及在底泥中的吸附性差，這也說(shuō)明了磺胺類抗菌藥物的遷移性強(qiáng)，對(duì)于其他地表水或地下水具有潛在的威脅。相反，四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物在底泥中具有很強(qiáng)的滯留性，大大延長(zhǎng)了四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物在環(huán)境中的停留時(shí)間，這也使得如果發(fā)生四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物的污染，那么底泥會(huì)是這2類抗菌藥物污染最嚴(yán)重的地方。

2.3 不同養(yǎng)殖模式的抗菌藥物含量

不同于富集在底泥中的抗菌藥物遷移性較差，水體中的抗菌藥物往往有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，因此更容易對(duì)人們?cè)斐捎绊憽１狙芯恐羞x取2個(gè)外塘甲魚池塘和2個(gè)溫室甲魚池塘、2個(gè)黑魚池塘（分別投放飼料和冰鮮）、2個(gè)鱸魚池塘（分別投放飼料和冰鮮）的養(yǎng)殖水作為研究對(duì)象。養(yǎng)殖水中三大類抗菌藥物的含量見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在溫室甲魚池塘中抗菌藥物的組成以四環(huán)素類和喹諾酮類為主，而在其他外塘中則主要是磺胺類。這是由于在外塘中，磺胺類抗菌藥物水溶性強(qiáng)，容易被檢測(cè)到，而四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物更容易富集于底泥中。相比之下，溫室甲魚池塘一般由水泥直接澆筑而成，并沒(méi)有底泥等沉積物，水中的四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物缺少了一條重要的轉(zhuǎn)移途徑，因此大量存在于池塘養(yǎng)殖水中。

除抗菌藥物的組成不同，溫室甲魚池塘中的抗菌藥物含量也遠(yuǎn)高于其他外塘養(yǎng)殖池塘，一方面由于底泥是抗菌藥物的重要富集區(qū)域，由“3.1”小結(jié)中看到湖州地區(qū)養(yǎng)殖池塘底泥中抗菌藥物的含量為“μg/kg”數(shù)量級(jí)，而養(yǎng)殖水中抗菌藥物含量為“ng/L”數(shù)量級(jí)，可見(jiàn)在缺少底泥的溫室甲魚池塘，大量的抗菌藥物無(wú)法被底泥吸附而游離在水環(huán)境中。另外，由于溫室甲魚因養(yǎng)殖密度過(guò)高，容易患“腐皮”等病害，在養(yǎng)殖過(guò)程中往往會(huì)持續(xù)用藥，造成養(yǎng)殖水中抗菌藥物濃度過(guò)高。其次，由于自然光降解是抗菌藥物在環(huán)境中消除的重要途徑之一，有研究表明，恩諾沙星在光照、避光條件下的降解半衰期分別為2.23、286.00 d[17]。溫室甲魚池塘常年處于無(wú)日照狀態(tài)， 因此也造成了喹諾酮類在溫室池塘中的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在外塘的含量。最后，由于溫室甲魚池塘為了保持甲魚的生長(zhǎng)環(huán)境，一般將水溫保持在20～30 ℃，過(guò)高的水溫會(huì)導(dǎo)致每一次換水都會(huì)有大量能量損失，因此養(yǎng)殖戶都會(huì)

選擇盡可能地減少換水次數(shù)，這也是溫室甲魚池塘中抗菌藥物維持在高濃度的一個(gè)原因。

作為外塘養(yǎng)殖，加州鱸池塘和黑魚池塘中的抗菌藥物主要是磺胺類，由圖2還可得出，不論投喂飼料還是冰鮮，加州鱸池塘中抗菌藥物含量要遠(yuǎn)高于黑魚池塘，這可能由于黑魚的養(yǎng)殖技術(shù)成熟，不易致病，而加州鱸本身對(duì)環(huán)境要求較高，生長(zhǎng)過(guò)程中容易得病，或許導(dǎo)致了抗菌藥物的大量投入。此外，檢測(cè)投喂冰鮮的池塘比投喂飼料的池塘得到更多抗菌藥物，這可能是由飼料的生產(chǎn)工藝相對(duì)穩(wěn)定、冰鮮來(lái)源不穩(wěn)定造成的，本研究抽取了2批次冰鮮進(jìn)行檢測(cè)，2份黑魚池塘投喂的冰鮮中均未檢測(cè)到抗菌藥物，在2份加州鱸池塘投喂的冰鮮中，其中1份冰鮮中檢測(cè)到金霉素和四環(huán)素的濃度分別是1.23、0.33 μg/kg?？梢?jiàn)，養(yǎng)殖戶無(wú)法保證每次購(gòu)買的冰鮮都不含抗菌藥物，畢竟我國(guó)在雞、鴨等養(yǎng)殖過(guò)程中均會(huì)使用抗菌藥物。據(jù)報(bào)道，在2013年我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)使用抗菌藥物量達(dá) 1.812萬(wàn)t，占全國(guó)抗菌藥物總使用量的11.18%[18]。

雖然本研究中投喂冰鮮的池塘中抗菌藥物含量較高，但由于研究基數(shù)較小，而引起養(yǎng)殖池塘中抗菌藥物含量增加的因素很多，如養(yǎng)殖戶不科學(xué)用藥、引進(jìn)水源所帶入的抗菌藥物或是由于上一輪養(yǎng)殖而殘留在底泥中的抗菌藥物又復(fù)溶到養(yǎng)殖水中等。因此，想要了解投喂冰鮮的養(yǎng)殖池塘中抗菌藥物的污染情況，還須做進(jìn)一步調(diào)查。

3 結(jié)論

在湖州3縣2區(qū)18個(gè)養(yǎng)殖塘中共檢測(cè)到15種抗菌藥物，其中養(yǎng)殖水中磺胺類抗菌藥物檢出率較高，底泥中四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物檢出率較高。養(yǎng)殖水中抗菌藥物含量為“ng/L”數(shù)量級(jí)，底泥中的抗菌藥物含量為“μg/kg”數(shù)量級(jí)。

磺胺類抗菌藥物在養(yǎng)殖水中不僅有較高的檢出率，還有很高的濃度，在環(huán)境中主要以溶解態(tài)存在，表現(xiàn)出很強(qiáng)的親水性，而四環(huán)素類和喹諾酮類抗菌藥物則主要富集在底泥中，這種現(xiàn)象可由抗菌藥物的底泥水分配系數(shù)Kd表述明確。

不同養(yǎng)殖模式的養(yǎng)殖塘中抗菌藥物含量差異很大。溫室甲魚塘中的抗菌藥物含量要遠(yuǎn)高于其他養(yǎng)殖塘，本研究中加州鱸養(yǎng)殖塘中抗菌藥物含量高于黑魚養(yǎng)殖塘，投喂飼料的養(yǎng)殖塘中抗菌藥物含量要高于投喂冰鮮的養(yǎng)殖塘。

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