郭歡歡 陳鈺輝楊錦坤 劉富中 張 映 連 勇

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁后被細(xì)胞膜包圍的細(xì)胞，其應(yīng)用研究主要通過原生質(zhì)體融合即體細(xì)胞雜交創(chuàng)制新的植物種質(zhì)。原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠克服有性雜交中只有親緣關(guān)系較近的物種間才能獲得雜交后代的局限性，轉(zhuǎn)移有性雜交方式中親本不能轉(zhuǎn)移的生物和非生物脅迫抗性，獲得包括植物種間、屬間及科間的體細(xì)胞雜種。原生質(zhì)體融合技術(shù)已在茄屬、煙草屬、柑橘屬、禾本科等植物中廣泛開展（喻艷，2013；常勝合 等，2018）。

茄子栽培種和大多數(shù)茄子近緣野生種都屬于茄科茄屬一年生草本植物。自然界中，茄子栽培種一般抗逆性（生物逆境和非生物逆境）較差，而野生茄子表現(xiàn)出較好的抗逆性和抗病性（Rotino et al，2014），因此常用作砧木使用，常用的砧木材料為刺天茄（Solanum indicum）、水茄（S. torvum）及赤茄（S. mammosum）等。但由于近年來單一砧木品種使用年限較長及不同地區(qū)病害生理小種發(fā)生變異等原因?qū)е抡枘酒贩N的抗病性下降，頻繁出現(xiàn)了嫁接苗發(fā)生大面積死秧現(xiàn)象（王爽 等，2013），因此需要?jiǎng)?chuàng)制出新的砧木資源。由于不同野生茄子品種抗病種類及抗病能力不同（張紅浩 等，2015），加上多數(shù)野生茄子間有性雜交不親和（Daunay，2008），制約了砧木資源的改良。利用原生質(zhì)體進(jìn)行體細(xì)胞雜交可以克服有性生殖的障礙，將不同抗病種類和抗病能力的野生材料融合成體細(xì)胞雜種植株，創(chuàng)制出新的野生砧木 材料。

研究人員通過原生質(zhì)體融合技術(shù)分別獲得茄子栽培種和野生茄子S. sisymbriifolium、S. khasianum、 S. torvum、S. nigrum、S. aethiopicum 體 細(xì)胞雜交四倍體株系，并部分轉(zhuǎn)移了野生資源中的優(yōu)良抗病 性（Gleddie et al.，1986；Guri & Sink，1988；Sihachakr et al.，1988，1989；Daunay et al.，1993；Jarl et al.，1999）。前人雖已建立了茄子原生質(zhì)體分離及融合的基本方法，但不同基因型原生質(zhì)體游離所需酶類和酶解時(shí)間等條件存在差異，對(duì)不同融合親本原生質(zhì)體游離及融合條件仍需進(jìn)一步探討。因此，本試驗(yàn)以蒜芥茄（S. sisymbriifolium）和水茄（S. torvum）為融合親本，主要探討不同酶類濃度、酶解時(shí)間和電融合基本參數(shù)對(duì)原生質(zhì)體游離及融合的影響，篩選出原生質(zhì)體游離及電融合最佳條件，以期為親本均為野生茄子的原生質(zhì)體游離及融合提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，并為創(chuàng)制茄子砧木種質(zhì)資源奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水茄（S. torvum）和蒜芥茄（S. sisymbriifolium）種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所茄子課題組提供。2017 年12 月于茄科實(shí)驗(yàn)室組培室開始進(jìn)行培養(yǎng)，原生質(zhì)體游離材料為茄子試管苗嫩葉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體獲得 挑取飽滿健康種子，在無菌操作臺(tái)中用70%的酒精浸泡30 s，10% NaClO3滅菌15 min，無菌水沖洗3 遍，吸干水分，然后接種于MS（3%蔗糖，0.75%瓊脂）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶置于14 h 光照/10 h 黑暗、光照強(qiáng)度2 200 lx、溫度25～27 ℃的組培室中培養(yǎng)。植株采用節(jié)間繼代培養(yǎng)，原生質(zhì)體游離使用的茄子苗在MS（2%蔗糖，0.75%瓊脂）培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，取上部嫩葉進(jìn)行原生質(zhì)體的游離純化。

1.2.2 酶解液濃度對(duì)原生質(zhì)體游離的影響 在無菌操作臺(tái)中分別取水茄和蒜芥茄試管苗上部幼嫩真葉1～2 g，利用解剖刀將嫩葉切成1 mm 左右寬度，然后浸泡在酶液中，在（25±1）℃黑暗下酶解。纖維素酶（Onozuka R-10，Yakultv，Japan）設(shè)0.2%（m/V，下同）、0.3%、0.4% 3 個(gè)濃度梯度，離析酶（Macerozyme R-10，Yakultv，Japan） 設(shè)0.05%、0.1%、0.2% 3 個(gè)濃度梯度，9 個(gè)酶液組合，在不同酶液組合條件下對(duì)葉片原生質(zhì)體游離情況進(jìn)行顯微鏡觀察比較，每個(gè)酶液組合重復(fù)3 次觀測，選定最優(yōu)酶解液。

1.2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體游離的影響 選定最優(yōu)酶解液后，測定不同酶解時(shí)間（9、10、11、12、13、14、15、16 h）對(duì)不同基因型茄子葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。每個(gè)酶解時(shí)間重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4 軟件進(jìn)行分析。通過比較不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)酶解時(shí)間。

1.2.4 電融合參數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合的影響 用電融合儀（ECM2001，USA）對(duì)游離純化后的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。對(duì)基本電融合參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，其中交流電場強(qiáng)度分別為60、70、80、90、100、 110 V · cm-1，交流電場作用時(shí)間以大多數(shù)細(xì)胞成串為3～4 個(gè)為準(zhǔn)，直流脈沖強(qiáng)度分別為1 200、1 250、1 300、1 350 V · cm-1，直流電場作用時(shí)間分別為40、45、50、55 μs，每次試驗(yàn)在研究某一參數(shù)時(shí)，其他參數(shù)保持某個(gè)數(shù)值不變，通過顯微觀測細(xì)胞狀態(tài)，確定最適電融合參數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液濃度對(duì)原生質(zhì)體游離的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），水茄和蒜芥茄葉片原生質(zhì)體在0.3%纖維素酶+0.1%離析酶條件下鏡檢觀測到的單細(xì)胞數(shù)量最多，其余酶解液濃度組合顯微觀察存在葉片解離不完全、單細(xì)胞量少、細(xì)胞破碎等情況，不利于原生質(zhì)體的游離。顯微鏡下觀測到在適宜的酶液濃度組合下，酶解充分，游離單細(xì)胞較多（圖1-A），放大觀測可見球體形狀規(guī)則的、透亮的完整細(xì)胞（圖1-B）；酶液濃度不適易造成細(xì)胞破碎，顯微鏡下觀測可見細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，有細(xì)胞碎片（圖1-C、D）。

表1 部分酶解液組合下葉片原生質(zhì)體游離效果觀測

2.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體游離的影響

在最優(yōu)酶解液濃度0.3%纖維素酶+0.1%離析酶條件下，對(duì)不同酶解時(shí)間下原生質(zhì)體產(chǎn)量進(jìn)行比較。結(jié)果表明（表2），蒜芥茄在13～15 h 酶解時(shí)間下的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，其中14 h 達(dá)到最大值15.06×106個(gè) · g-1。水茄在11～13 h 酶解時(shí)間下的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，其中13 h 達(dá)到最大值15.92×106個(gè) · g-1。酶解時(shí)間過短或過長都會(huì)影響原生質(zhì)體產(chǎn)量，酶解時(shí)間過短，酶解不充分，不利于原生質(zhì)體游離，影響原生質(zhì)體產(chǎn)量；酶解時(shí)間過長，原生質(zhì)體脫壁完全，導(dǎo)致質(zhì)膜受到損傷，從而使原生質(zhì)體死亡數(shù)量增加。

2.3 電融合參數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

顯微觀測表明，在交變電場作用下，雙親原生質(zhì)體沿電場方向形成很多平行排列的串珠，交變電場越大，串珠形成越快；交變電場作用時(shí)間越長，串珠形成也加長（圖2-A）。然后施加直流脈沖電壓后，串珠迅速解體，形成了很多長短不一的包括由兩個(gè)原生質(zhì)體形成的小串珠，部分小串珠很快融合在一起（圖2-B、C），直流脈沖電壓越大或作用時(shí)間越長，顯微觀測可見多核體多，原生質(zhì)體破裂的多（圖2-D、E）。本試驗(yàn)中確定基本電融合參數(shù)為交流電場強(qiáng)度80 V · cm-1，交流電場作用時(shí)間10 s，直流脈沖強(qiáng)度1 250 V · cm-1，直流電場作用時(shí)間 45 μs，次數(shù)1 次時(shí)，顯微鏡觀測大多數(shù)細(xì)胞成串為3～4 個(gè)，大多數(shù)為兩細(xì)胞之間發(fā)生融合，且細(xì)胞破碎少，融合效果好（圖2-B、C）。

圖1 野生茄子葉片原生質(zhì)體游離效果

表2 酶解時(shí)間對(duì)不同基因型野生茄子葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖2 野生茄子原生質(zhì)體在不同電融合參數(shù)條件下的融合效果

3 結(jié)論與討論

酶的種類、濃度是影響原生質(zhì)體游離的重要因素。纖維素酶用于在植物原生質(zhì)體中裂解細(xì)胞壁，離析酶用于從葉肉細(xì)胞中分離出單個(gè)細(xì)胞。酶濃度過低，會(huì)使細(xì)胞壁裂解不充分，游離不出原生質(zhì)體；酶濃度過高會(huì)損害原生質(zhì)體，導(dǎo)致其破碎、活性下降。前人研究顯示在喀西茄（S. khasianum）和癲茄（S. aculeatissimum）原生質(zhì)體融合試驗(yàn)中，其葉片原生質(zhì)體游離使用0.8%（m/V，下同）纖維素酶R-10 和0.2%離析酶R-10（Stattmann et al.，1994）；栽 培 茄（S. melongena L.）分別 與 水茄 （S. torvum）和南美紅茄（S. aethiopicum）進(jìn)行原生質(zhì)體融合時(shí)，其葉片原生質(zhì)體游離使用1.5%纖 維 素 酶R-10 和0.5% 離 析 酶R-10（Sihachakr et al.，1989；Daunay et al.，1993）；栽培茄和紫色非洲茄屬（S. marginatum）葉片原生質(zhì)體游離使用0.1%纖維素酶R-10 和0.2%離析酶R-10（Borgato et al.，2007）。不同基因型的植物由于葉片組織結(jié)構(gòu)上的差異，從而使得在原生質(zhì)體分離去壁酶解過程中酶解條件存在一定差異（喻艷，2013）。本試驗(yàn)中水茄和蒜芥茄葉片原生質(zhì)體游離最適酶液濃度是0.3%纖維素酶R-10+0.1%離析酶R-10，在這個(gè)濃度下顯微鏡觀測到的單細(xì)胞數(shù)量最多。由此可見，對(duì)于不同基因型植物，即使是同一屬，其最適酶解濃度也不同，在進(jìn)行原生質(zhì)體游離時(shí)都需要研究確定最適酶解濃度。

酶解時(shí)間對(duì)植物原生質(zhì)體產(chǎn)量有很大影響。酶解時(shí)間過短，不能達(dá)到較好的分離效果；時(shí)間過長，酶對(duì)已分離出的原生質(zhì)體就會(huì)產(chǎn)生毒害作用。栽培茄（S. melongena L.）、水茄（S. torvum）和紫色非洲茄屬（S. marginatum）的酶解時(shí)間為16 h （Guri & Sink，1988；Borgato et al.，2007）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒜芥茄（S. sisymbriifolium）最適酶解時(shí)間是14 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)最大值15.06×106個(gè) · g-1，水茄（S. torvum）最適酶解時(shí)間是13 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)最大值15.92×106個(gè) · g-1。本試驗(yàn)結(jié)果和前人不同，說明不同基因型植物在相同酶種類和濃度條件下，獲得最大原生質(zhì)體產(chǎn)量所需要的酶解時(shí)間不同，選擇合適的酶解時(shí)間才能獲得大量高活性原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體電融合可分解為兩步，首先是交流電場使得原生質(zhì)體3～4 個(gè)串在一起，然后給予直流脈沖使得串在一起的原生質(zhì)體發(fā)生融合，交變電壓過高，無論直流脈沖電壓多么低，原生質(zhì)體也會(huì)破裂，若交變電壓過低，無論脈沖電壓多么高，融合也很少發(fā)生，電融合參數(shù)影響融合效果（郭文武 等，1998；田國奎 等，2012）。不同基因型茄子原生質(zhì)體電融合參數(shù)不同，研究表明，栽培茄（S. melongena L.）和水茄（S. torvum）或南美紅茄（S. aethiopicum）使用電融合參數(shù)為交流電場強(qiáng)度125 V · cm-1，作用時(shí)間15 s，直流脈沖強(qiáng)度1 200 V · cm-1，作用時(shí)間20 μs，次數(shù)2 次（Sihachakr et al.，1989；Daunay et al.，1993）； 栽 培 茄（S. melongena L.）和紫色非洲茄屬（S. marginatum）使用電融合參數(shù)為交流電場強(qiáng)度125 V · cm-1，作用時(shí)間15 s，直流脈沖強(qiáng)度1 500～2 000 V · cm-1，作用時(shí)間50 μs，次數(shù)3 次（Borgato et al.，2007）。本試驗(yàn)中，交流電場強(qiáng)度為80 V · cm-1，作用時(shí)間10 s，直流脈沖強(qiáng)度1 250 V · cm-1，作用時(shí)間 45 μs，次數(shù)1 次時(shí)，顯微鏡觀測到大多數(shù)細(xì)胞成串為3～4個(gè)，融合效果較好。與前人試驗(yàn)所用電融合參數(shù)相比，本試驗(yàn)所用電流強(qiáng)度和時(shí)間不同，說明不同基因型茄子在電融合時(shí)需要確定適當(dāng)?shù)碾娙诤蠀?shù)，參數(shù)的確定對(duì)能否獲得大部分兩細(xì)胞融合是非常必要的。