張 競(jìng) ，楊君君 ，柴 欣 ，王躍飛 ，楊 靜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.滄州市中心醫(yī)院藥學(xué)部，滄州 061001）

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifoliaL.）的干燥成熟果實(shí)，主要產(chǎn)自云南、四川等地，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛。補(bǔ)骨脂其性辛、苦，溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[1]。近年來研究表明，補(bǔ)骨脂在抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、調(diào)節(jié)雌激素水平[6]等方面均具有顯著的藥理作用。補(bǔ)骨脂鹽炙法收錄于2015版《中華人民共和國(guó)藥典》，補(bǔ)骨脂經(jīng)鹽炙可增強(qiáng)止瀉作用，降低燥性，降低毒副作用[1]。

現(xiàn)有的化學(xué)對(duì)照品、對(duì)照提取物無法完全反映出中藥飲片科學(xué)內(nèi)涵與特征屬性[7]。作為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片的研究具有重要的意義。標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻化制備直接影響其內(nèi)涵特征的表達(dá)，其中粉碎工藝的優(yōu)化是標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化過程的重要環(huán)節(jié)之一[8]。補(bǔ)骨脂飲片粉末化研究有利于補(bǔ)骨脂飲片的質(zhì)量監(jiān)管。本文采用不同目數(shù)藥篩制備不同粒度的補(bǔ)骨脂飲片粉末，對(duì)其粉末分布及指標(biāo)成分含量差異進(jìn)行研究，并以粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)、投料量為因素，借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法[9-10]，通過出粉率、主要成分的總含量計(jì)算歸一化面積（S），采用正交實(shí)驗(yàn)法以S為指標(biāo)對(duì)影響因素進(jìn)行研究，優(yōu)選最佳粉碎工藝，為制定補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末均勻化工藝的技術(shù)規(guī)范提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLC system（美國(guó)沃特世公司），XS 205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SCIENTZ SB 25-12DTN型超聲波清洗器（寧波新芝生物有限公司，功率：300W，頻率：40 kHz），TGL-16C 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），F(xiàn)W80粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），微量進(jìn)樣器（平頭10 μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司），硅膠G板（200 mm×100 mm，青島海洋化工分廠）。

1.2 藥品及試劑 對(duì)照品：補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：110738-201313）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：110739-201115）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為＞98%；補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷（實(shí)驗(yàn)室自制，NMR、MS鑒定化合物結(jié)構(gòu)，UPLC-UV分析純度＞98%）。甲醇、甲酸均為色譜純，食用鹽，水為超純水。

生補(bǔ)骨脂：補(bǔ)骨脂藥材購自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；鹽補(bǔ)骨脂：嚴(yán)格按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》鹽炙法（通則0213）炮制。

補(bǔ)骨脂是生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂的統(tǒng)稱；補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素分別簡(jiǎn)寫為PO、IPO、P、IP。

2 方法

2.1 色譜條件 超高效液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-0.1%甲酸水（A）溶液，梯度洗脫（0～6 min，90% → 40%A）；柱溫：60℃；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

薄層色譜條件：按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中薄層色譜法（通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取樣品和對(duì)照品溶液各2～4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 分別取PO、IPO、P、IP各5 mg，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL分別含有PO 0.798 mg、IPO 1.018 mg、P 1.140 mg、IP 1.284 mg 的儲(chǔ)備液，供定量分析用。

分別取P、IP對(duì)照品2 mg，精密稱定，加乙酸乙酯配制成每1 mL含P、IP各1 mg的混合對(duì)照品溶液，供薄層鑒別用。

2.3 供試品溶液的制備 取補(bǔ)骨脂粉末0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇適量，密塞，60℃超聲處理（功率300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液 1 mL，加 1 mL 30%甲醇水溶液（V∶V），搖勻，供定量分析用[9]。

取補(bǔ)骨脂粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL三角瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，供薄層鑒別用[1]。

2.4 補(bǔ)骨脂飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)研究 以出粉率、指標(biāo)成分的總含量為指標(biāo)，借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法[10-11]，優(yōu)選最佳粉碎工藝。生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂中出粉率為Ga和G'a；PO、IPO、P、IP的總量為Za和Z'a，其中a為不同粉碎方式（9個(gè)正交實(shí)驗(yàn)組，a為1～9）的補(bǔ)骨脂飲片粉末樣品。

為了消除不同指標(biāo)取值范圍差異對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響，對(duì)不同指標(biāo)的變量進(jìn)行歸一化處理。生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂樣品中最大出粉率為Ga（max）和G'a（max）；PO、IPO 和 P、IP 的最高總含量為 Za（max）和Z'a（max）。將不同指標(biāo)的數(shù)值分別除以該指標(biāo)的最大值，得到出粉率的歸一化結(jié)果分別為Qa和Q'a，PO、IPO和P、IP總量的歸一化結(jié)果分別為Ha和H'a。計(jì)算公式1、2如下所示。

通過計(jì)算Qa和Ha（Q'a和H'a）構(gòu)成的陰影部分面積，優(yōu)選生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂飲片的最佳粉碎方式，其歸一化面積分別為S和S'，計(jì)算公式3、4如下所示。

2.5 生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂飲片最佳粉碎工藝驗(yàn)證研究 取生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂，采用補(bǔ)骨脂最佳粉碎工藝制備補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末，計(jì)算出粉率；按“2.3”項(xiàng)下方法制備補(bǔ)骨脂飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中PO、IPO、P、IP的含量。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂飲片的粉末分布及其指標(biāo)成分的含量變化研究 分別取生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂各100 g，粉碎機(jī)單次粉碎20 s，采用《中國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)藥篩制備不同目數(shù)的粉末，稱取不同藥篩上未通過該藥篩的樣品粉末質(zhì)量，分別計(jì)算其比例，結(jié)果見表1。按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品A～H（生補(bǔ)骨脂飲片粉末）和樣品A'～H'（鹽補(bǔ)骨脂飲片粉末），分別制備供定量分析用與供薄層鑒別用的樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下薄層色譜條件鑒別不同粒度的補(bǔ)骨脂飲片粉末，結(jié)果見圖1。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中PO、IPO、P、IP的含量，結(jié)果見圖2。

表1 不同補(bǔ)骨脂飲片粉末質(zhì)量分布結(jié)果Tab.1 The results of powder weight distribution for different Fructus Psoraleae

表1結(jié)果顯示，100%補(bǔ)骨脂飲片粉末通過10目篩，89.02%生補(bǔ)骨脂粉末和97.34%鹽補(bǔ)骨脂粉通過24目篩，56.24%生補(bǔ)骨脂粉末和62.40%鹽補(bǔ)骨脂粉通過50目篩。由圖1、2可知，補(bǔ)骨脂飲片中P、IP、PO、IPO 4個(gè)指標(biāo)成分的質(zhì)量隨著標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)的改變而變化，補(bǔ)骨脂飲片不同目數(shù)標(biāo)準(zhǔn)篩上的粉末中PO、IPO含量隨著標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)增加而減少，P、IP的含量隨著標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)增加而增加；薄層色譜結(jié)果顯示P、IP的熒光斑點(diǎn)隨著標(biāo)準(zhǔn)篩目數(shù)增加而增強(qiáng)，與含量測(cè)定趨勢(shì)一致。

圖1 不同生補(bǔ)骨脂飲片粉末（A）、鹽補(bǔ)骨脂飲片粉末（B）薄層色譜圖Fig.1 The thin-layer chromatography of the powder from raw Fructus Psoralea（A）and from salt-processed Fructus Psoraleae（B）

圖2 不同補(bǔ)骨脂飲片粉末質(zhì)量（A）、指標(biāo)成分含量（B）及指標(biāo)成分質(zhì)量（C）的柱狀圖Fig.2 The histograms of powder weight（A），target components content（B）and target components mass（C）from Fructus Psoraleae

補(bǔ)骨脂飲片由果皮和種子組成，補(bǔ)骨脂果皮主要含有P、IP等脂溶性成分，易粉碎；補(bǔ)骨脂種子主要含有PO、IPO，質(zhì)地堅(jiān)硬不易粉碎[12]。因此，粒度越小的飲片粉末主要為補(bǔ)骨脂果皮粉末（易粉碎），P、IP含量較高；越大的飲片粉末主要為種子粉末（不易粉碎），PO、IPO含量較高，P、IP含量較低。

3.2 補(bǔ)骨脂飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)研究 結(jié)合“3.1”的結(jié)果和《中國(guó)藥典》補(bǔ)骨脂項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定，采用標(biāo)準(zhǔn)三號(hào)藥篩（50目）篩取制備補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)飲片粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備補(bǔ)骨脂飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中指標(biāo)成分的含量。按“2.4”項(xiàng)下方法，以粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)、投料量（以投料藥材占粉碎室的體積計(jì)）為因素，以出粉率、化合物含量為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳粉碎工藝，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)骨脂飲片粉碎工藝正交實(shí)驗(yàn)表Tab.2 The orthogonal experiment table of pulverization process for Fructus Psoraleae

通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)助手對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以歸一化面積（S）為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察不同因素對(duì)生補(bǔ)骨脂飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：B＞A＞C，最佳粉碎工藝為A2B3C1，即投料量為1/4粉碎室的體積，單次粉碎時(shí)間30 s，粉碎3次，過50目篩，即得；考察不同因素對(duì)鹽補(bǔ)骨脂飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：B＞C＞A，最佳粉碎工藝為A2B2C2，即投料量為1/3粉碎室的體積，單次粉碎時(shí)間30 s，粉碎2次，過50目篩，即得。測(cè)定結(jié)果見圖3。

3.3 生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂飲片最佳粉碎工藝驗(yàn)證研究 按“2.5”項(xiàng)下方法，采用最佳粉碎工藝制備的生補(bǔ)骨脂飲片的出粉率97.42%，RSD為0.02%（n=3）；PO、IPO、P、IP 的總含量為 0.127 8 mmol/g，RSD為0.77%（n=3），說明生補(bǔ)骨脂最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。采用最佳粉碎工藝制備的鹽補(bǔ)骨脂飲片的出粉率 97.15%，RSD 為 0.35%（n=3）；PO、IPO、P、IP 的總含量為 0.130 6 mmol/g，RSD 為 1.71%（n=3），說明鹽補(bǔ)骨脂最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法，通過出粉率、指標(biāo)成分的總含量計(jì)算歸一化面積（S），采用正交實(shí)驗(yàn)法以S為指標(biāo)對(duì)補(bǔ)骨脂飲片進(jìn)行粉末均勻化工藝研究，經(jīng)粉碎工藝放大驗(yàn)證，該方法可行。

圖3 基于“蛛網(wǎng)模式”研究方法計(jì)算的補(bǔ)骨脂飲片粉碎工藝研究結(jié)果的歸一化面積
Fig.3 Normalized area of research results of pulverization process for Fructus Psoraleae based on“Spider-web”mode